Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de Aparelhos de Solução e Perfusão
- Monte um aparelho de Langendorff de fluxo constante (disponível comercialmente ou feito por você mesmo). A Figura 1 fornece um esquema simples.
- Preparar as soluções de acordo com os reagentes indicados no quadro 1 e no quadro 2.
- Ligue o banho-maria circulante e ajuste uma temperatura de entrada adequada (42,7 °C em nosso laboratório) para garantir que a saída do sistema de circulação de perfusato da cânula atinja 37 °C.
- Limpe o sistema de perfusão circulando água deionizada. Se for necessária uma condição estéril, passe etanol a 75% pelo sistema de perfusão por 15 min, seguido de água deionizada (pelo menos 10 ciclos para evitar efeitos de toxicidade do álcool no coração).
- Meça o tempo e o volume de um ciclo do sistema de circulação de perfusato para determinar quantos mililitros de solução oxigenada de Tyrode devem ser carregados na etapa de perfusão seguinte.
- Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas no método desejado.
- Defina a taxa de fluxo do sistema de perfusão de perfusato em 4 mL / min.
- Prepare duas placas de Petri limpas de 35 mm - uma contendo a solução de Tyrode (placa de Petri 1), a outra contendo a solução 1 (placa de Petri 2).
- Prepare uma seringa de 1 ml cheia de solução 1 e uma agulha de cânula de aço rombo de 20 G com um entalhe de 1 mm até à ponta. Prepare um nó solto com sutura 3-0 na haste da cânula. Regule o campo de visualização do estereomicroscópio e certifique-se de que a ponta da cânula esteja abaixo da superfície líquida da placa de Petri 2.
2. Preparação Animal
- Administre heparina (concentração, 1.000 UI / mL; 0,2 mL / camundongo) por via intraperitoneal aos camundongos para evitar coágulos sanguíneos. Após 10 minutos, anestesiar os camundongos com pentobarbital sódico (50 mg / kg, injeção intravenosa) e garantir que os camundongos parem de responder aos beliscões da cauda / dedo do pé. Realize a luxação cervical 20 min após a administração da heparina.
- Transfira os camundongos para a plataforma cirúrgica, fixe-os em decúbito dorsal, esterilize o tórax com etanol a 75% e seque-o com gaze ou guardanapo.
3. Excisão do coração e canulação da aorta
- Levante a pele do xifóide com uma pinça de tecido e faça uma pequena incisão lateral através da pele com uma tesoura de tecido. Faça uma dissecção romba entre a pele e a fáscia e estenda a incisão da pele em forma de V em direção às axilas em ambos os lados.
- Continue o mesmo traçado de incisão através da caixa torácica e, em seguida, desvie a caixa torácica para cima, apertando o esterno com uma pinça de tecido para expor totalmente o coração e os pulmões.
- Retire o pericárdio usando uma pinça curva. Rasgue a glândula timo em ambos os lados com duas pinças curvas se cobrir os grandes vasos. Puxe suavemente a base do coração em direção à cauda com uma pinça curva até que um vaso sanguíneo em forma de "Y" (a aorta e suas artérias ramificadas) possa ser visto.
- Para reservar diferentes comprimentos da aorta para canulação e comparação, faça o transeccionamento da aorta na artéria carótida comum esquerda (linha verde na Figura 2) e corte a artéria braquiocefálica ao mesmo tempo em alguns camundongos. Transecto na aorta ascendente em outros camundongos (linha preta na Figura 2).
nota: Para aqueles que são novos neste procedimento, esta etapa também pode ser feita sob um microscópio estereoscópico.
- Extirpar o coração e mergulhar imediatamente na placa de Petri 1 para lavar e bombear o sangue residual.
- Transfira o coração para a placa de Petri 2 e corte qualquer tecido excedente usando uma tesoura de íris fina, se necessário. Para aqueles que são novos neste procedimento, faça esta etapa sob o estereomicroscópio para evitar cortar erroneamente a aorta ou outras estruturas cardíacas.
- Empurre a seringa para expelir as bolhas de ar antes da canulação da aorta. Realize a canulação retrógrada da aorta com o auxílio de duas pinças de amarração retas (mandíbulas lisas) sob o estereomicroscópio. Certifique-se de que todo o processo de canulação esteja sob a superfície do líquido.
- Evite penetrar nas valvas aórticas e ajuste as profundidades para a aorta ascendente (o camundongo que a aorta foi seccionada na artéria carótida comum esquerda) e a raiz da aorta (o camundongo que a aorta foi seccionada na aorta ascendente), respectivamente.
nota: A profundidade da canulação da aorta (referida simplesmente como profundidade) é definida aqui como a posição em que a ponta da cânula está na aorta ou onde a aorta está ligada.
- Ligue a aorta com a sutura pré-nó 3-0 até o entalhe da cânula. Pressione suavemente o conteúdo da seringa para enxaguar o sangue residual.
nota: O sangue sairá das artérias coronárias e se espalhará das veias dorsais se a profundidade estiver posicionada corretamente. O coração e os apêndices atriais se expandirão e ficarão pálidos.
- Remova e conecte a cânula ao aparelho de Langendorff. Mais uma vez, tome cuidado para evitar que bolhas de ar entrem no coração.
nota: Esteja ciente de que o tempo desde a toracotomia até a perfusão inicial não deve exceder 5 min.
- Para a perfusão cardíaca, primeiro, prepare e perfunda a solução oxigenada de Tyrode por aproximadamente 10 s (o volume de líquido que corre 10 s no sistema usado neste protocolo é de aproximadamente 0,7 mL) se houver sangue residual nos átrios e, em seguida, mude para a solução 1. No entanto, apenas perfunda com a solução 1 se não houver sangue residual nos átrios. Perfundir o coração por aproximadamente 2 min.
Tabela 1. Soluções para isolamento de CM de camundongos adultos.
| solução | Conteúdo (concentração final em mmol/l, se não especificada de outra forma) | Observou |
| Solução de perfusão (solução 1) | 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurina, 5 Glicose, 10 2,3-butanodiona monóxido (BDM) | Que pode ser armazenado por 3 dias a 4 °C. Glicose, taurina e BDM são adicionados no dia do experimento. Prepare 200 mL de solução de perfusão para cada coração. |
| Solução de Tyrode (solução 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 glicose | Que pode ser armazenado por 3 dias a 4 °C. CaCl2 e glicose são adicionados no dia do experimento, ajuste o pH para 7,3-7,4 com NaOH saturado à temperatura ambiente (28-30°C) com um medidor de PH. |
Tabela 2. Soluções para isolamento e armazenamento de CM de camundongos adultos.
| solução | conteúdo | Observou |
| Solução de digestão (solução 3) | 25 ml de solução 1, 6 μL de CaCl2 a 100 mM/L, 25 mg de colagenase II, tripsina a 50 μL (2,5 % 10×) | Para cada coração |
| Pare a solução 1 (solução 4) | 9 mL solução 1, 1 mL FBS (soro fetal bovino), 4μL 100 mM/L CaCl2 | Para cada coração |
| Pare a solução 2 (solução 5) | 9,5 mL solução 1, 0,5 mL FBS (soro fetal bovino), 4μL 100 mM/L CaCl2 | Para cada coração |
| Solução de ressuspensão celular (solução 6) | 13 mL solução 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) em uma dose que pode formar uma fina camada cobrindo a superfície do líquido | Para cada coração |
