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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação e intubação de camundongos
- Anestesiar camundongos jovens C57B1 / J6 (20-25 g) por inalação de sevoflurano a 8% com 0,5-1,0 L / min 100% O2 em um tubo cônico.
- Verifique a profundidade da anestesia usando o reflexo de retirada da pinça do dedo do pé.
- Coloque o camundongo em decúbito dorsal em uma placa inclinada e prossiga para a intubação orotraqueal.
- Mova o mouse para a almofada de aquecimento e conecte rapidamente o tubo orotraqueal ao ventilador para iniciar a ventilação mecânica.
- Ajuste os parâmetros do ventilador para uma frequência de 160 respirações/min e um volume corrente de 10 mL/kg.
2. Preparação para cirurgia (para cirurgias de bandagem e dissolução)
- Faça a barba e aplique o creme depilatório do decote até o meio do peito dos ratos.
- Aplique gel oftálmico nos olhos dos animais para evitar o ressecamento da córnea.
- Coloque uma sonda retal e o oxímetro na pata ou cauda para monitorar a temperatura, a oxigenação do sangue e a frequência cardíaca, respectivamente.
NOTA: A anestesia induz hipotermia significativa, portanto, é importante manter a temperatura corporal normal durante a cirurgia para evitar uma rápida diminuição da frequência cardíaca.
- Manter a anestesia com sevoflurano (2,0–3,0%). Verifique o nível correto de anestesia pela falta do reflexo de pinça do dedo do pé.
- Coloque os camundongos em decúbito lateral direito em uma almofada de aquecimento e prenda os membros ao sistema de retração do fixador magnético com uma fita adesiva para manter o animal na posição correta durante a cirurgia (Figura 1, Figura 2A).
- Desinfete o peito do rato com álcool a 70% seguido de solução de iodopovidona.
3. Cirurgia de bandagem da aorta ascendente
- Com uma lâmina descartável, faça uma pequena incisão na pele (~0,5 cm) no lado esquerdo imediatamente abaixo do nível da axila e disseque a pele.
- Disseque e separe suavemente o músculo peitoral e outras camadas musculares até que as costelas se tornem visíveis. Use pinças finas e evite cortar o músculo.
- Ao microscópio, identifique os espaços intercostais e abra uma pequena incisão entre o2º e o3º espaço intercostal com uma pinça fina.
- Retraia as costelas colocando o afastador torácico (Figura 1A).
- Use uma pequena pinça para dissecar e separar suavemente os lobos tímicos até que a aorta ascendente se torne visível.
nota: Aplicadores de algodão devem ser úteis em caso de sangramento. Solução salina estéril quente deve ser administrada por via subcutânea em caso de sangramento significativo (por exemplo, a artéria mamária).
- Use uma pequena pinça para dissecar suavemente a aorta.
NOTA: A aorta é considerada dissecada quando não há gordura ou outras aderências ao seu redor e é possível circundar facilmente o vaso com uma pequena pinça curva.
- Após a dissecção da aorta, colocar uma ligadura de polipropileno 7-0 ao redor da aorta usando auxiliar de ligadura e pinça curva (Figura 1B).
- Posicione a agulha embotada de 26 G paralela à aorta (ponta apontada para a cabeça do camundongo) (Figura 1B). Para camundongos pesando 20 a 25 g, esta agulha induz uma constrição aórtica reprodutível de 65 a 70%.
- Faça 2 nós soltos ao redor da aorta e da agulha 26 G com a ajuda de 2 pinças (Figura 1B).
- Aperte o 1º nó e, logo em seguida, o2º nó. Confirme brevemente o posicionamento correto da constrição e remova rapidamente a agulha para restaurar o fluxo sanguíneo aórtico. Por fim, faça um3º nó (grupo BA).
- Reposicione o timo e os músculos em sua posição inicial.
- Realize o procedimento simulado idêntico ao procedimento de constrição, mas mantendo a sutura solta ao redor da aorta (grupo SHAM).
- Corte as extremidades da sutura e retire o afastador de tórax.
NOTA: As extremidades curtas da sutura podem aumentar a probabilidade de afrouxamento dos nós com a pressão aórtica, enquanto as extremidades longas tornam o procedimento de dissolução mais arriscado, pois podem ocorrer aderências entre a sutura e o átrio esquerdo.
- Feche a parede torácica com sutura de polipropileno 6-0 com sutura simples interrompida ou contínua com o menor número de pontos possível. Aperte o último nó torácico com os pulmões inflados no final da inspiração, retirando a saída do ventilador por 2s para inflar novamente os pulmões.
- Feche a pele com uma sutura de seda/polipropileno 6-0 em um padrão de sutura contínua.
NOTA: Se um ventilador mais recente for usado, é possível programá-lo para pausar na inspiração (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
4. Cuidados pós-operatórios
- Aplique a solução de iodopovidona no local da sutura da pele.
- Para analgesia adequada, administre buprenorfina por via subcutânea 0,1 mg / kg, duas vezes ao dia, até que o animal se recupere totalmente (geralmente 2 a 3 dias após a cirurgia).
- Injete solução salina estéril por via intraperitoneal para evitar desidratação em caso de sangramento significativo durante a cirurgia.
- Desligue a anestesia (sem desintubar o rato) e espere até que o animal recupere os reflexos (os movimentos dos bigodes são um sinal de despertar) e comece a respirar espontaneamente.
- Remova a cânula traqueal.
- Deixe o animal se recuperar em uma incubadora a 37 °C.
- Retorne o animal para uma sala de ciclo claro/escuro de 12 h após a recuperação completa.
5. Cirurgia de Debandação Aórtica
- Sete semanas depois, realizar a debandagem da aorta em metade dos animais BA.
- Repita todas as etapas 1.1 a 2.6 mencionadas acima.
- Disseque suavemente os tecidos, aderências e fibrose ao redor da aorta até que sua constrição se torne visível.
- Disseque cuidadosamente a aorta e separe a sutura da aorta. Corte a sutura com uma tesoura de mola inclinada (Figura 2B).
- Feche a parede torácica com fio de polipropileno 6-0 com sutura simples interrompida ou contínua com o menor número de pontos possível.
NOTA: Tente apertar a última sutura torácica quando os pulmões estiverem inflados para evitar pneumotórax.
- Feche a pele com uma sutura de seda/polipropileno 6-0 em um padrão de sutura contínua.
- Execute todos os procedimentos de cuidados pós-operatórios conforme mencionado na etapa 4.
