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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE
1. Preparação da solução de corante azul de metileno
- Meça 0,1 g de pó de azul de metileno.
- Dissolva o azul de metileno em 10 mL de solução salina normal ou 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) completamente por vórtice.
- Filtre a solução de azul de metileno de 10 mg / mL com um filtro de seringa (tamanho do poro da membrana 0,45 μm) para eliminar o entupimento durante a injeção.
- Monte um conjunto de veias estéreis do couro cabeludo (27 G x 3/4") com uma seringa descartável de 3 mL e encha a seringa com 3 mL de solução filtrada de azul de metileno.
nota: Para evitar a pressão hidrostática e o subsequente fluxo de corante, coloque a ponta da agulha acima da seringa cheia de solução de azul de metileno.
2. Dissecção de embriões pré-natais
- Limpe as tesouras e pinças de dissecação com etanol a 70%.
- Para coletar embriões perinatais em E18.5 ou E19.5, eutanasiar camundongos prenhes primeiro usando inalação de CO2 e, em seguida, realizar a luxação cervical de acordo com as diretrizes do NIH.
nota: A rata grávida geralmente dá à luz a partir de E18.5, no entanto, rins maiores são mais fáceis de manipular. Portanto, os rins em E19.5 mais próximos do nascimento são mais fáceis de realizar esta análise. No entanto, filhotes com obstruções bilaterais do trato urinário morrem após o nascimento. Dependendo das características dos camundongos experimentais, um dia/hora de coleta apropriado deve ser determinado empiricamente.
- Pulverize etanol a 70% na superfície abdominal ventral e, em seguida, abra a cavidade abdominal ventralmente usando tesouras de dissecação e pinças.
- Levante todo o útero e separe-o do corpo cortando com uma tesoura de dissecação as pontas dos cornos uterinos.
- Enxágue todo o útero com 1x PBS em uma placa de Petri.
- Corte o útero segmentalmente com uma tesoura de dissecação e remova a decídua placentária com uma pinça de dissecação para expor os embriões em sacos vitelinos.
- Remova o saco vitelino primeiro e, em seguida, remova a membrana amniótica com uma pinça de dissecação para liberar os embriões perinatais.
- Decapite um embrião com uma tesoura de dissecação. Limpe o excesso de sangue com compressas de gaze estéreis. Prenda o embrião com sua superfície ventral para cima em um microscópio de dissecação equipado com uma câmera digital para imagens. Colete sua cauda para genotipagem, se necessário.
nota: Realize injeções um embrião de cada vez.
- Abra cuidadosamente a cavidade abdominal de um embrião com uma pinça, rasgando a pele. Em seguida, remova cuidadosamente o excesso de órgãos e tecidos, como fígado, estômago e intestino, com uma pinça, cortando-os ou puxando-os para fora para expor os rins, os ureteres e a bexiga que estão localizados dorsalmente (Figura 1A). Absorva o excesso de sangue do embrião dissecado com compressas de gaze estéreis, se necessário.
nota: O excesso de sangue interfere na identificação da pelve renal para a injeção do corante.
3. Injeção de corante azul de metileno na pelve renal e monitoramento do fluxo de corante
- Remova as bolhas na agulha e no tubo expelindo a solução de azul de metileno da ponta da agulha por pressão hidrostática. Levante a seringa que contém a solução corante acima do nível da ponta da agulha para iniciar o fluxo e, em seguida, abaixe a seringa para interromper o fluxo.
- Insira a agulha na pelve renal perto do ureter proximal, tomando cuidado para não perturbá-la depois de colocada. Realize a injeção de corante em um rim para determinar sua obstrução do trato urinário.
nota: Realize a injeção de corante em qualquer rim anormal, primeiro, seguindo o mesmo caminho para determinar sua obstrução do trato urinário.
- Levante a seringa cerca de 20 cm para fornecer pressão hidrostática e deixe fluir 15 μL a 60 μL da solução corante. A taxa de fluxo será de cerca de 3 μL / s se a seringa for elevada a esta altura acima do embrião.
- Monitore a cor azul do corante começando primeiro na pelve renal, depois no comprimento do ureter e, finalmente, no lúmen da bexiga.
nota: Demora cerca de 5 s para ver uma cor de corante fraca emergir dentro do lúmen da bexiga se o ureter estiver inserido corretamente na bexiga. Deixe o corante se acumular no local bloqueado por cerca de 15 s se nenhuma cor de corante aparecer no lúmen da bexiga.
- Coloque a seringa para baixo para interromper o fluxo de corante e remova a agulha do rim.
- Tire imagens do rim, do ureter e da bexiga traçadas com solução de corante usando a câmera e o programa de imagem conectado a um estereomicroscópio.
- Faça um registro da hidronefrose do rim, do hidroureter e da posição final da solução de corante em um caderno de laboratório.
- Realize a injeção do rim contralateral conforme descrito nas etapas 3.1 a 3.5 e permita o fluxo de corante cerca de 20 s no total.
nota: O lúmen da bexiga será preenchido com solução de corante, indicada por uma forte cor azul, se o ureter estiver inserido corretamente no lúmen da bexiga. Após a avaliação da obstrução da junção do trato urinário, os ureteres e a bexiga podem ser fixados para secção.
