Isolamento de ovário de camundongo neonatal: um procedimento cirúrgico para colher par de ovários do modelo de camundongo neonatal

Resumo

Fonte: et al. Morgan, S. Cultura e co-cultura de ovários de camundongos e folículos ovarianos. J. Vis. Exp. (2015).

Neste vídeo, descrevemos um procedimento cirúrgico para isolar ovários de um camundongo neonatal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dissecção e cultura de ovário neonatal

1. Coloque 1 mL de meio de dissecção (dissolva 3 mg / mL de BSA em meio Leibowitz L15 e esterilize por filtro através de um poro de 0,2 μm e filtro de 25 mm de diâmetro) em cada placa de embrião de vidro estéril.
2. Abater filhotes de camundongos neonatais com idade entre os dias 0 e 5 pós-natal, descarte por decapitação.
3. Segure a pele que cobre a parede abdominal usando uma pinça de dissecção fina e faça uma grande incisão na pele e na parede corporal. Abra a incisão para que todo o abdômen fique exposto. A bexiga geralmente é ingurgitada nesta fase e pode ser perfurada para facilitar a dissecção.
4. Mova as entranhas para fora do caminho usando uma pinça de relojoeiro. Siga os chifres uterinos da bexiga até o rim de cada lado. O ovário está localizado logo abaixo do rim, na parte superior do útero, e aparecerá como uma estrutura semelhante a uma nuvem sob um microscópio de dissecação.
5. Segure o ovário suavemente com uma pinça de relojoeiro e use uma tesoura para cortar sua fixação ao útero. Transfira o par de ovários para placas de embriões contendo meio de dissecção pré-aquecido.
6. Efectuar a dissecção fina dos ovários ao microscópio de dissecação numa fase aquecida (37 °C). Use agulhas de insulina para aparar o saco bursal e qualquer excesso de material, incluindo a trompa de Falópio, até que apenas o ovário permaneça.
7. Transfira cada ovário para o poço de uma placa de cultura usando uma pipeta de vidro curvo finamente desenhada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Leibowitz L15	Invitrogen	11415049
αMEM	Invitrogen	22571020	Fornecido como tamponamento de bicarbonato de sódio (2.200 mg/L)
Albumina de soro bovino	Sigma Aldrich	A9418	Para meio de dissecção
Albumina de soro bovino	Sigma Aldrich	Resposta 3311	Para meio de cultura
Albumina de soro bovino	Sigma Aldrich	A2153	Para revestimento de pipetas de vidro
Fsh	Merck Serono	Gonal F	O teste em lote geralmente é necessário. Preparar a solução de estoque de 1IU/10μL em αMEM e armazenar a -20 °C
Filtros de seringa (25 mm, 0,2 μm)	Greiner	16532K	Filtro de acetato de celulose para filtrar volumes maiores (>5 mL) de meio.
Tubos estéreis	Greiner	187261
Placa de 24 poços	Greiner	Nº 662160
Agulhas de insulina	Suprimentos médicos BD	Telefone: 037-7606	0,33 mm (29 G) + 1 mL
Pratos de embriões de vidro	VWR	Rolamento 720-0579	Esterilize e aqueça antes de usar
Pipetas de vidro	Fisher Científico	10209381	BSA revestido antes do uso
Agulhas de acupuntura	Acumedic LTDA	30 mm x 0,25 Tipo C
Solução de formalina, tamponada neutra, 10%	Sigma Aldrich	HT5014-120mL
Membranas de nucleóporos Whatman	Camlab	WN/110414	Use superfície brilhante para cima, policarbonato, 13 mm de diâmetro, tamanho de poro de 8,0 μm