$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Animais
- Manter camundongos fêmeas adultos de 3 a 6 semanas de idade em uma sala com temperatura e umidade controladas (com fases de 12L:12D e alimentadas ad libitum).
- Injete em camundongos por via intraperitoneal 2,5 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG) para estimular o crescimento folicular, imitando os efeitos do hormônio folículo estimulante (FSH). Isole os ovários para coleta de oócitos antrais 48 h depois. Eutanasiar o camundongo fêmea previamente injetado com PMSG, de acordo com as diretrizes padrão.
- Remova rapidamente os ovários da cavidade corporal e coloque-os na placa de Petri contendo meio M2 para posterior isolamento dos oócitos (ver seção 3).
- Faça uma incisão na pele que cobre a parede abdominal seguida de uma incisão no peritônio usando uma tesoura de dissecção estéril. Abra a incisão para expor o abdômen, mova as entranhas de um lado usando uma pinça estéril e localize as tubas uterinas, formando uma forma de V a partir da bexiga.
- Observe os ovários localizados abaixo dos rins. Segure cada tubo com uma pinça estéril e faça uma pequena incisão na parte inferior dos ovários para liberá-los. Transfira os dois ovários no fundo de uma placa de Petri contendo meio pré-equilibrado.
2. Preparação hormonal
- Dilua o PMSG (disponível em diferentes concentrações de estoque) com solução salina isotônica estéril para obter uma concentração de trabalho de hormônio 2,5 UI por 0,1 mL para um volume de injeção apropriado.
nota: As soluções hormonais devem ser alíquotas em tubos de 0,5 ml e conservadas a -20 °C até ao dia da utilização. Não conservar as alíquotas diluídas durante mais de três meses a -20 °C. Uma vez descongelado, se forem realizadas injeções em série, armazene as alíquotas das soluções hormonais a +4 °C e use-as dentro de 4 dias.
3. Isolamento de Oócitos Antrais
Para isolamento adequado de oócitos:
- Equilibre o meio M2 (M2) a 5% de CO2 e 37 °C por pelo menos 1 h antes de iniciar o procedimento de isolamento de ovócitos. Prepare duas placas de Petri (35 mm x 10 mm), uma com 1 mL de M2 para perfuração do ovário e a segunda com pequenas gotas (20 μL) de M2 cobertas com óleo mineral (~ 1,5 mL) para transferência de oócitos após o isolamento do ovário (consulte as etapas 3.4 a 3.6). Mantenha ambas as placas de Petri na incubadora a 5% de CO2 e 37 °C até que estejam prontas para serem usadas.
- Use um estereomicroscópio durante os procedimentos de isolamento de oócitos.
- Prepare pipetas de vidro de boca fina para coletar os oócitos esticando pipetas de vidro Pasteur mantidas horizontalmente (segurando as extremidades da pipeta com as duas mãos), sobre uma chama vertical proveniente do bico de Bunsen (Figura 1).
- Assim que o vidro começar a derreter, retire a pipeta do fogo e faça um movimento rápido de puxar para obter a pipeta desejada. Corte firmemente o excesso de vidro próximo ao ponto estreito da pipeta com as unhas para ajustar o comprimento e o diâmetro do capilar interno. Certifique-se de que o capilar fino tenha um diâmetro interno de ~ 100 μm, ligeiramente maior que o diâmetro do oócito (~ 80 μm).
- Para pipetar de boca, conecte uma extremidade do tubo de aspiração à pipeta puxada usando uma ponta apropriada e coloque a outra extremidade na boca, prendendo-a com os dentes.
- Colete os ovários usando uma pinça estéril e deposite-os no fundo de uma placa de Petri de cultura de células (35 mm x 10 mm). Cubra-os com 1 mL de M2 previamente equilibrado a 37 °C e 5% de CO2 (Figura 2).
- Perfure suavemente os folículos antrais dos ovários com uma agulha de seringa de insulina estéril para liberar oócitos antrais em M2 (Figura 3).
- Pique suavemente os oócitos através de uma pipeta estreita de Pasteur para remover as células foliculares e quaisquer outros possíveis detritos teciduais (Figura 4A) e, em seguida, coloque-os no fundo de pequenas gotas (20 μL) de M2 cobertas com óleo mineral adequado para cultura de embriões (previamente preparado; Figura 4B).
nota: É importante remover todas as células do cumulus ligadas à zona pelúcida dos oócitos por pipetagem contínua através de várias e diferentes gotas de M2. Execute esta etapa o mais rápido possível para evitar alterações no pH do meio.
