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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Injeções duplas de resina
- preparação
- Prepare a solução de resina. Para injeções de resina de sistema duplo, prepare resinas amarelas e verdes conforme descrito nas etapas 1.1.2-1.1.4.
- Preparar alíquotas de 1 ml de resina diluída por ratinho.
- Resina amarela: Dilua a borracha de silicone amarela (alta radiopacidade) com o diluente transparente em uma diluição de 3:1 para preparar a resina amarela para injeção.
- Resina verde: Misture borracha de silicone azul (radiopacidade indetectável) com o diluente transparente em uma diluição de 1:1 para preparar a resina azul. Para gerar resina verde, misture a resina azul diluída com a resina amarela diluída na proporção de 1:1. Vortex a resina verde completamente até que a cor fique homogênea.
nota: A resina azul tem radiopacidade muito baixa que não é detectável com microCT, o que, portanto, necessita de diluição com resina amarela para criar duas resinas com radiopacidades diferentes.
cuidado: A resina pode conter cromato de chumbo, que é cancerígeno. Produz gases venenosos em um incêndio. Manuseie com cuidado e descarte a resina como resíduo perigoso.
- Prepare dois conjuntos de injeção (conjunto de injeção #1 e conjunto de injeção #2) com tubulação conforme descrito nas etapas 1.1.6-1.1.11.
nota: Para camundongos adultos (>P30 (dia pós-natal 30) = P30 - 2 anos), use o conjunto de injeção #1 (tubo PE10 com diâmetro externo de 0,6 mm) para injeção do ducto biliar comum e o conjunto de injeção #2 (tubo PE50 com diâmetro externo de 0,96 mm) para injeção na veia porta. Para camundongos pós-natais jovens (até P30), prepare dois conjuntos de injeção # 1, um para o ducto biliar e outro para injeção na veia porta (sem conjunto de injeção # 2, pois a veia porta é muito estreita para acomodar o tubo PE50).
- Para preparar o conjunto de injeção #1, corte 30 cm do tubo PE10 e estique uma extremidade do tubo com a mão, puxando-o até que fique o mais fino possível (Figura 1A, B, aproximadamente 0,15 mm de diâmetro, o tubo PE10 não esticado tem 0,6 mm de diâmetro).
- Corte a ponta do tubo PE10 esticado na diagonal para criar uma ponta chanfrada (Figura 1B).
- Conecte a extremidade não esticada do tubo PE10 a uma agulha de 30 G (Figura 1A, conjunto de injeção #1).
- Para preparar o conjunto de injeção # 2, corte 30 cm de tubo PE50 e estique uma extremidade do tubo com a mão, puxando-o até que fique fino o suficiente para caber na veia porta (Figura 1A, B, aproximadamente 0,7 mm, tubo PE50 não esticado tem 0,96 mm de diâmetro).
- Corte a ponta do tubo PE50 esticado diagonalmente para criar uma ponta chanfrada (Figura 1B).
- Conecte a extremidade não esticada do tubo PE50 a uma agulha de 23 G (Figura 1A, conjunto de injeção #2).
nota: Cada conjunto de injeção só pode ser usado para uma injeção, pois a resina endurecerá na seringa e no tubo. Ajuste o tamanho da ponta esticada e chanfrada com base no tamanho do ducto biliar comum e da veia porta do camundongo, dependendo de sua idade, genótipo e fenótipo. Quando não tiver certeza sobre o tamanho e o ajuste do tubo, insira o tubo no duto ou vaso apropriado após a incisão e antes que o tubo seja preenchido com resina. Se a tubulação for muito larga para caber no duto/vaso, estique-a ainda mais.
- Anestesiar o animal por inalação de isoflurano (primeiros 4% na câmara de indução e ~ 2% usando o cone nasal).
- Coloque o mouse em uma bancada ventilada em uma almofada de dissecção enquanto o mouse respira isoflurano pelo cone do nariz. Verifique se o animal está inconsciente por um método recomendado pelo instituto/IRB, por exemplo, beliscando uma das patas.
cuidado: O isoflurano pode causar sonolência ou tontura por inalação e pode causar danos ao sistema cardiovascular e ao sistema nervoso central por exposição prolongada ou repetida. Não inale. Manuseie a substância em bancada ventilada e em áreas bem ventiladas.
nota: É possível utilizar outro método anestésico, desde que compatível com a perfusão cardíaca.
- Quando o animal estiver inconsciente, borrife o lado ventral com etanol 70% para evitar a interferência do pelo.
- Usando uma tesoura de pele, corte a pele, a fáscia e a camada muscular começando na linha média da cavidade abdominal e corte até a cavidade torácica para expor os órgãos internos.
- Pegue o processo xifóide com uma pinça para levantar o esterno e corte o diafragma e a caixa torácica em ambos os lados para expor o coração e os pulmões.
- Remova a caixa torácica cortando as costelas nos lados esquerdo e direito da caixa torácica com uma tesoura. Tome cuidado extra para não danificar o fígado, pois isso resultará em vazamento da resina.
- Usando uma pinça reta, puxe o coração em direção ao fígado e corte o átrio direito.
- Insira uma agulha borboleta (23 G), conectada a uma bomba de perfusão peristáltica, no ventrículo esquerdo. Perfunda o camundongo transcardiologicamente com solução salina balanceada de Hanks (HBSS) e heparina (1 U/g de peso corporal do camundongo). Perfundir por 3 min com uma taxa de perfusão de 5 mL/min.
nota: Se o camundongo estiver sendo perfundido corretamente, os órgãos internos ficarão pálidos, especialmente o fígado. Se, em vez disso, os pulmões estiverem ficando brancos, a agulha é inserida no ventrículo direito e deve ser reposicionada. Após a perfusão, o camundongo é exsanguinado e pode ser removido do cone do nariz e do isoflurano.
- Desligue a bomba de isoflurano.
2. Injeção de resina - fundição de resina do sistema biliar
- Mova o mouse para o microscópio de dissecação, abdômen para cima, cauda em direção ao experimentador e afaste-se dele. Os marcos anatômicos de interesse são representados na Figura 2A.
- Localize a veia cava inferior (Figura 2A) movendo o intestino para o lado. Use uma tesoura de mola para fazer uma pequena incisão transversal na veia cava inferior para permitir a liberação da pressão vascular hepática (Figura 2Bi).
- Exponha o ducto colédoco e a veia porta conforme descrito nas etapas 1.2.4 a 1.2.6.
- Mova o intestino e o pâncreas para o lado direito (do experimentador) usando um cotonete umedecido com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Vire o lado ventral do fígado em direção ao coração usando o cotonete umedecido com PBS para expor a superfície visceral e a região hilar.
- Localize o ducto colédoco que vai da região hilar através do pâncreas e entra no intestino no esfíncter de Oddi (Figura 2Bii, ducto colédoco comum delineado com a linha pontilhada amarela, pontas de setas pretas apontam para o esfíncter de Oddi).
nota: Certifique-se de que o fígado esteja úmido durante todo o procedimento, polvilhando-o com PBS.
- Limpe o tecido circundante (área ~ 5 mm) do ducto colédoco usando uma pinça reta. Coloque o fio de sutura de seda (tamanho 4-0, 0,17 mm, 3-5 cm de comprimento) sob o ducto colédoco (Figura 2Bii) e dê um nó solto ao redor do colédoco (Figura 2Biii).
nota: Escolha uma área para o nó a meio caminho entre a região hilar e o esfíncter de Oddi e a alguma distância da veia porta para que, após a sutura ser apertada ao redor do ducto colédoco, ela não interfira na injeção da veia porta.
- Segure a tesoura de mola contra o ducto colédoco para fazer uma incisão oblíqua no ducto colédoco no local onde o ducto colédoco entra no pâncreas e no intestino próximo ao esfíncter de Oddi. (Figura 2Biv), linha pontilhada amarela delimita o esfíncter da região de Oddi, enfatizado por pontas de setas pretas).
nota: Este é um passo crucial. Faça um corte oblíquo e não transversal, e faça uma incisão; Não corte o ducto biliar. Cortar todo o ducto biliar torna a inserção do tubo muito desafiadora.
- Imediatamente antes de usar, misture 1 mL da resina amarela com 50 μL do agente de cura (enchendo e esvaziando a seringa de 1 mL) e encha uma seringa Luer de 1 mL com a mistura de agente de cura de resina.
- Conecte a seringa cheia com o tubo (conjunto #1). Pressione o êmbolo para encher completamente a tubulação. Certifique-se de que a mistura de resina/agente de cura goteje da ponta da tubulação.
nota: Evite e remova bolhas na seringa e no tubo para obter melhores resultados.
- Usando uma pinça, endireite a área ao redor da incisão do ducto colédoco e insira o tubo na abertura do ducto colédoco (Figura 2Bv), com a borda mais longa da ponta chanfrada para baixo em direção ao lado dorsal do ducto biliar. Essa orientação garante que a resina possa sair da abertura da tubulação, que está voltada para cima, para o duto ( Figura 2Bv ).
- Aperte o nó do fio de seda para prender o tubo dentro do ducto biliar comum (Figura 2Bvi).
- Injete a resina no ducto colédoco. Observe a vesícula biliar e os lobos do fígado individuais.
- Massageie o fígado com um cotonete umedecido com PBS para ajudar a espalhar a resina igualmente. Os ramos terminais dos ductos biliares cheios de resina (em camundongos do tipo selvagem) são fracamente visíveis na superfície do fígado.
nota: O tempo esperado para encher o fígado é de 30-100 s.
- Pare de injetar a resina quando pontos de resina aparecerem na superfície do fígado (Figura 2Ci, pontas de setas azuis) ou quando a resistência for encontrada.
nota: Trabalhe o mais rápido possível, pois a resina começa a endurecer após a adição do agente de cura da resina. O tempo de trabalho da adição do agente de cura é de aproximadamente 15 min.
- Remova o tubo puxando-o para fora do ducto biliar comum e aperte rapidamente o nó de seda usando uma pinça para evitar que a resina vaze. Corte as pontas soltas da sutura de seda, para que não interfiram na injeção da veia porta.
- Descarte o tubo contendo resina e a resina restante nos resíduos perigosos e a agulha nos resíduos perfurocortantes.
