Isolamento do nó sinoatrial do modelo de camundongo: um procedimento para colher o nó SA do coração murino

Resumo

Fonte: Kumar, P et al., Registro de matriz de microeletrodos da taxa de disparo do nó sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcapasso cardíaco em camundongos. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar o nó sinoatrial ou SAN do coração do camundongo. O SAN abriga as células sinoatriais que iniciam os batimentos cardíacos gerando potenciais de ação espontâneos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dissecando o nó sinoatrial (SAN)

1. Prepare a solução completa de Tyrode heparinizada para dissecação de SAN.
   1. Adicione 400 μL de heparina (1.000 USP / mL) a 40 mL de solução completa de Tyrode e aqueça em banho-maria a 37 ° C.
2. Injete no camundongo por via intraperitoneal 200-300 μL de heparina (1000 USP/mL) e deixe o animal sentar por 10 min.
3. Eutanásia do camundongo heparinizado por overdose de isoflurano.
   1. Coloque o mouse em uma pequena câmara de vidro que contenha vapores de isoflurano gerados pela adição de 200-300 μL de isoflurano líquido a um papel de filtro dentro de um tubo de plástico perfurado.
      NOTA: Como o isoflurano pode causar irritação na pele e também pode ser absorvido pela pele, o líquido não deve entrar em contato direto com o camundongo. Portanto, o lenço embebido em isoflurano é colocado em um tubo perfurado para administração.
   2. Verifique a morte por cessação do movimento e do esforço respiratório e pela ausência de reflexo de pinça do dedo do pé. A morte geralmente leva cerca de 1-2 minutos após a colocação na câmara.
      nota: A morte geralmente é acompanhada de micção.
4. Coloque o mouse em decúbito dorsal em uma placa de dissecação com as patas estendidas e fixe as patas na placa usando agulhas de seringa calibre 23 de 1 polegada de comprimento. Em seguida, remova o pelo nas proximidades da parte inferior da caixa torácica usando uma tesoura cirúrgica e cortando o pelo pela raiz.
   nota: Para uma placa de dissecação, podem ser usadas tampas de poliestireno.
5. Enquanto segura a pele com um hemostático, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão transversal na pele logo abaixo da parte inferior da caixa torácica, do arco costal esquerdo ao arco costal direito (Figura 1A).
6. Abra o peritônio com uma tesoura cirúrgica e separe cuidadosamente o fígado do diafragma, tomando cuidado para não cortar o fígado, o que causará sangramento excessivo (Figura 1B). Incisar o diafragma ao longo do tórax para expor a cavidade torácica (Figura 1C-D).
7. Com tesoura cirúrgica, corte as paredes laterais da caixa torácica desde as bordas dos arcos costais até as clavículas para expor o coração, tomando cuidado para não danificar o coração (Figura 1D). Em seguida, use uma agulha de seringa calibre 23 para prender a caixa torácica sobre o ombro, segurando-a no lugar e fora do caminho do campo cirúrgico.
8. Use uma pipeta de transferência para pingar a solução de Tyrode completa heparinizada quente (37 °C) no coração para mantê-lo úmido.
   nota: Não permita que o coração seque.
9. Remova os pulmões segurando-os com pinças Graefe extra finas e cortando a traqueia com tesoura cirúrgica (Figura 1E).
10. Segure o ápice do coração com uma pinça Graefe extra fina e remova-o cortando a aorta e as veias cavas com uma tesoura cirúrgica. Transfira o coração para uma placa de Petri contendo elastômero de silicone curado (Figura 2A) e use uma pipeta de transferência para banhar o coração com 2-3 mL de solução completa de Tyrode heparinizada quente (37 °C).
    nota: Tenha cuidado para não danificar a delicada parede posterior dos átrios direitos, que contém o SAN, e as veias atriais direitas conectadas. Banhar o coração com a solução de Complete Tyrode evita que o coração seque, mas não mergulhe totalmente o coração na solução, pois prejudicará a visibilidade durante a dissecção.
11. Oriente o coração com o átrio direito à direita do experimentador e o átrio esquerdo à esquerda do experimentador.
    nota: A dissecção do tecido SAN deve ser feita rapidamente para evitar lesões relacionadas à isquemia.
12. Prenda o ápice do coração ao prato com um pino de dissecação. Em seguida, enquanto segura a veia cava inferior com pinça de laminectomia Dumont #2, insira uma agulha de seringa 22 G através da veia cava inferior e superior para localizar sua posição no átrio direito, que também identifica a posição aproximada do SAN (localizado no remendo de tecido entre a veia cava inferior e superior (Figura 2B).
13. Usando pequenos pinos de dissecção, prenda os apêndices atriais esquerdo e direito no prato.
    1. Enquanto segura o apêndice atrial esquerdo com uma pinça de laminectomia Dumont # 2, coloque um pino de dissecção no apêndice atrial esquerdo para mantê-lo no lugar.
    2. Enquanto segura o apêndice atrial direito com uma pinça Dumont #55, coloque um pino de dissecção através do apêndice atrial direito para mantê-lo no lugar.
       nota: O mesmo tipo de fórceps pode ser usado para segurar os apêndices atriais esquerdo e direito, se desejado.
14. Remova a agulha da seringa que atravessa as veias cavas.
15. Para liberar sangue do coração, use uma tesoura de Castroviejo para remover o ápice do coração (ou seja, a metade inferior) fazendo uma incisão transversal através dos ventrículos (Figura 2C). Em seguida, lave o coração adicionando uma pipeta de transferência com uma pipeta de transferência de solução completa heparinizada a quente (37 °C).
16. Use uma tesoura Castroviejo para cortar ao longo do septo atrioventricular, mantendo a incisão mais próxima do ventrículo do que dos átrios. Continue cortando ao longo do septo atrioventricular até que os átrios sejam separados dos ventrículos.
17. Corte ao longo do septo interatrial para remover o átrio esquerdo.
18. Coloque os pinos de dissecção na periferia do átrio direito para que fique plano (Figura 2D). Remova qualquer gordura, vasos ou tecido restante do átrio usando a tesoura Castroviejo.
19. Localize o SAN no átrio direito, que nesta orientação é aproximadamente delimitado pela veia cava superior (na parte superior), veia cava inferior (na parte inferior) e crista terminal (à esquerda) (Figura 2D).
    NOTA: A crista terminal aparece como uma crista muscular escura entre o apêndice atrial direito e o SAN. Freqüentemente, a artéria SAN também pode ser vista percorrendo a SAN (Figura 2D).

Resultados

Figura 1: Remoção do coração.(A) Incisão transversal na pele logo abaixo da parte inferior da caixa torácica, de cerca do arco costal esquerdo ao arco costal direito. (B) Incisão peritoneal. (C,D) Incisão do diafragma ao longo do tórax para expor a cavidade torácica. (E) Remoção do coração após a excisão dos pulmões.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
agulha de seringa de calibre 22	Fisher Científico	14-826-5A	Usado para dissecação
agulha de seringa de calibre 23	Fisher Científico	14-826-6C	Usado para dissecação
Placas de Petri de 60 mm	Genesee Científico	32-105G
Tesoura Castroviejo, 4"	Ferramentas de Belas Ciências	15024-10
Microscópio de dissecção	Jenco
Pinos de dissecação	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 26002-20
Dumont #2 Pinça de Laminectomia	Ferramentas de Belas Ciências	11223-20
Fórceps Dumont #55	Ferramentas de Belas Ciências	11295-51
Pinça Graefe Extra Fina	Ferramentas de Belas Ciências	11152-10
hemostato	Ferramentas de Belas Ciências	13013-14
heparina	Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram	NDC 63739-953-25
Kit de Elastômero Sylgruard	Dow Corning	184 KIT SIL ELAST 0,5KG
Tesoura cirúrgica	Ferramentas de Belas Ciências	14074-09
Pipetas de transferência (3mL graduados)	Samco Científico	225
Isoflurano	Patterson Veterinário	07-893-1389