Sistema de Infusão Contínua de Medicamentos em Modelo de Camundongo: Um Procedimento Cirúrgico para Implantar Sistema de Infusão de Bomba Micro-osmótica no Cérebro de Camundongo para Administração Contínua de Medicamentos

Resumo

Fonte: Ajoy, R., Chou, S. Y. Estudando o sinal de insulina hipotalâmica para intolerância periférica à glicose com um sistema de infusão contínua de drogas no cérebro de camundongos. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos a montagem de um sistema de infusão cerebral com bomba micro-osmótica seguida de sua implantação cirúrgica no crânio do camundongo. Este sistema permite a entrega contínua de medicamentos potenciais e facilita o estudo de seus efeitos no cérebro e no tecido cerebral.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de sistemas de infusão de bomba micro-osmótica

NOTA: Prepare a bomba, o tampão do líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) e o medicamento (solução de proteína Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL em aCSF)) em condições estéreis usando tampões filtrados com filtros de 0.2 μm e conduza todos os procedimentos sob o capuz de cultura com luvas. Os procedimentos cirúrgicos são realizados da seguinte forma:

1. Prepare as bombas micro-osmóticas um dia antes da cirurgia: Encha a bomba micro-osmótica cerebral com líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) com uma seringa de 1 mL e agulha de cabeça romba fornecida junto com o kit. Mergulhe a bomba micro-osmótica em aCSF e coloque-a em um shaker e agite suavemente durante a noite.
   CUIDADO: A bomba deve ser preenchida com aCSF e bolhas de ar devem ser evitadas dentro da bomba (Figura 1A).
2. Antes de iniciar a cirurgia, prepare a solução de proteína Met-CCL5/RANTES recombinante (10 ng/mL, diluída em aCSF) para ser usada no experimento. Remova o aCSF da bomba e encha a bomba com a solução do medicamento lentamente até que o excesso vaze.
   NOTA: 15 mL de solução de aCSF ou Met-CCL5 / RANTES é suficiente para 5-8 bombas.
   CUIDADO: Repita o procedimento para garantir que a bomba esteja completamente cheia com o medicamento sem bolhas no interior.
3. Corte os tubos do cateter no comprimento desejado e prenda-os com a agulha de infusão cerebral de ponta romba no kit de infusão cerebral. Encha o kit de infusão e os tubos com o medicamento.
4. Por fim, monte e conecte o kit de infusão cerebral à bomba micro-osmótica.
   CUIDADO: Nenhuma bolha deve ser formada no tubo ou na bomba (Figura 1A).
5. Mergulhe todo o conjunto de fusão osmótica bomba-cérebro em aCSF em um tubo esterilizado de 50 mL para evitar que a bomba seque. O conjunto de fusão bomba osmótica-cérebro agora está pronto para ser usado para cirurgia.
   NOTA: Os sistemas de bomba micro-osmótica podem ser usados para infusão de medicamentos a longo prazo. Isso garante um modo seguro e conveniente de entrega de medicamentos no cérebro do camundongo.

2. Cirurgia Intracerebral Ventricular – implante da bomba microosmótica

CUIDADO: Esterilize o ambiente cirúrgico com etanol a 75% e certifique-se de que as pessoas envolvidas no estudo estejam usando luvas estéreis e jaleco limpo. As ferramentas/instrumentos cirúrgicos devem ser autoclavados e secos antes do uso e, posteriormente, esterilizados com etanol a 75% entre as cirurgias em camundongos.

1. Pese o camundongo e anestesieste-o com injeção intraperitoneal (IP) com cetamina/xilazina (cetamina 50 mg/kg, xilazina 10 mg/kg).
   CUIDADO: Pesos corporais de camundongos inferiores a 24 g não são recomendados para cirurgia de implante de bomba osmótica.
2. Monte e fixe a cabeça do mouse no aparelho estereotáxico (Figura 1B).
3. Use uma tesoura cirúrgica e pinças para abrir a pele externa que cobre o crânio. Use iodo para limpar o crânio periférico.
4. Separe a camada mais externa da pele subcutânea com a ajuda de um par de pinças de cabeça romba perto da região do pescoço para o implante do conjunto de fusão bomba-cérebro osmótico (Figura 1C).
5. Marque o ponto de infusão com referência ao mapa cerebral (Figura 1D) usando o aparelho estereotáxico. Neste experimento, a agulha precisa ser implantada na região do^3º ventrículo (Bregma: 0,0 mm lateral, 1,3 mm posterior, 5,7 mm ventral).
6. Faça um furo usando uma broca de pregos ao redor da área marcada no crânio (Figura 1E).
   CUIDADO: Tenha cuidado para não quebrar as meninges e vasos sanguíneos do camundongo, evitando assim a ruptura dos microvasos sanguíneos no cérebro.
7. Coloque o conjunto de fusão micro-osmótica bomba-cérebro contendo aCSF (como controle) ou droga (solução de proteína Met-CCL5 / RANTES) sob a pele atrás da região do pescoço e insira a agulha de infusão cerebral no orifício perfurado para infundir a droga no cérebro do camundongo ( Figura 1E ). A agulha penetrará nas meninges e entrará no ventrículo. Fixe a agulha no crânio usando gel dessensibilizante de superfície (Figura 1F) e aguarde 1-2 min até que a cola seque. Em seguida, corte a parte saliente na parte superior da agulha (Figura 1G-H).
8. Use uma cola adesiva de tecido para curar a ferida de operação na cabeça. Aplique 50 μL da cola em cima da ferida, junte os dois lados da pele e segure por 30 s para permitir que a pele sele (Figura 1I).
   CUIDADO: Use compressa com álcool 100% para limpar a ferida após a cirurgia e 100 ul de penicilina com estreptomicina para prevenir infecções. NOTA: A pele do camundongo formará tecido cicatricial e cicatrizará em alguns dias após a administração da cola cirúrgica. A principal vantagem da cola é evitar pontos cirúrgicos que podem causar irritação ou inflamação da pele.
9. Coloque o camundongo em uma gaiola limpa mantida em uma placa quente (aquecida até 37 °C) e espere até que o camundongo se recupere do efeito anestésico.
   CUIDADO: É fundamental manter a temperatura corporal do camundongo para aumentar a chance de sobrevivência após a cirurgia.
10. Após um período de recuperação de uma semana, os camundongos estarão prontos para novos experimentos, como o Teste Oral de Tolerância à Glicose (OGTT) e o Teste de Tolerância à Insulina (ITT).

Resultados

Figura 1. Procedimento cirúrgico de preparação e implantação da bomba osmótica em camundongo. (A) O kit de infusão cerebral e a preparação da bomba perfundidos com solução medicamentosa. As setas vermelhas indicam os tubos do cateter cheios de líquido. (B) Fixe e monte a cabeça do mouse no aparelho estereotáxico. (C) Separe a camada mais externa da pele da pele subcu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Adesivo de tecido Vetbond	3m	#1049SB	A cola usada para selar o local da lesão na cabeça do camundongo
Adesivo instantâneo LOCTITE 454	Corporação Durect	#8670	A cola usada para fixar a agulha no crânio do rato
Bomba Micro-Osmótica Alzet	Corporação Durect	#9922	0,11 μl por hora, 28 dias
Sistema de infusão cerebral	Corporação Durect	#8851	1-3 mm, usado para perfundir a droga no cérebro de camundongos
UNIDADE DE CONTROLE MIO-NE116 (broca de pregos)	Sistema Mio	#E235-015	Para fazer um furo no crânio do rato
Fórmula aCSF	119 mM NaCl 26,2 mM NaHCO3 2,5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1,3 mM MgCl2 10 mM glicose		Filtre esterilize com um aparelho de filtro de 0,22 μm e armazene a 4 ° C. aCSF é estável por 3-4 semanas