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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparo de camundongos e inserção de cateter na veia jugular
NOTA: Aqui, foram utilizados camundongos repórteres mTmG machos ou fêmeas de 5 a 7 semanas de idade (B6.129(Cg) Gt(ROSA)26Sortm4(ACTBtdTomato,-EGFP)Luo10) cruzados com camundongos Pf4-cre, permitindo intensa marcação de fluorescência verde em megacariócitos e plaquetas. Antes de iniciar o experimento, pré-aqueça a câmara de aquecimento do microscópio por algumas horas.
- Transporte o mouse para a sala de imagem e prossiga para a anestesia.
- Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de uma solução de cetamina (cetamina (100 μg/g) e xilazina (10 μg/g) (5 μL/g).
nota: A administração repetida de cetamina / xilazina é usada aqui e funciona bem, mas requer a interrupção da gravação para reinjeção regular. Alternativamente, se uma máquina de anestesia estiver disponível, a indução da anestesia pode ser realizada com cetamina/xilazina e posteriormente mantida sob inalação de gases (mistura de isoflurano, ar e oxigênio).
- Recoloque o animal em sua gaiola até atingir a anestesia profunda. Coloque o mouse em uma placa aquecida a 37 °C para todas as manipulações subsequentes.
nota: Enquanto o animal atinge a anestesia profunda, ligue o microscópio e todos os equipamentos e configure os diferentes parâmetros necessários para iniciar o experimento assim que a cirurgia for concluída. Aqui, o procedimento dura apenas 3 h e é terminal. O camundongo é sacrificado após o experimento sem acordar. Portanto, a desinfecção com etanol para pele e instrumentos é suficiente. No entanto, dependendo das diretrizes institucionais, ou se o procedimento durar mais, métodos de desinfecção mais completos devem ser usados, como três esfoliantes alternados com betadine/povidona e álcool.
2. Instale um cateter na veia jugular.
NOTA: É importante evitar ao máximo a contaminação microbiana durante a cirurgia. Tome cuidado para desinfetar cuidadosamente a pele com etanol a 70% (EtOH) antes de prosseguir com a cirurgia. Sempre use tesouras e pinças esterilizadas e enxágue-as regularmente em EtOH 70%. Trabalhe em um local limpo e use uma máscara facial. Um cateter "sobre a agulha" de 22 G, que consiste em uma agulha dentro de um tubo de plástico, é usado para injeção intravenosa (consulte a Tabela de Materiais).
- Coloque o mouse de costas e fixe as pernas anteriores com fita cirúrgica para esticar a garganta (Figura 1A). Desinfete a garganta com etanol 70%.
nota: Por conveniência, a garganta pode ser raspada antes da cirurgia. Se o procedimento durar mais tempo, deve-se realizar um barbear cuidadoso para uma técnica asséptica adequada.
- Faça uma incisão de 0,7-1 cm sobre a veia jugular direita ou esquerda usando uma tesoura estéril. Estique o tecido conjuntivo adjacente para expor a veia jugular externa e a parte superior do músculo peitoral (Figura 1A).
- Encha o cateter com solução salina fisiológica morna e estéril. Insira o cateter na veia após penetrar no músculo peitoral (Figura 1B).
nota: Tome cuidado para evitar bolhas de ar dentro do cateter. É importante inserir o cateter através do músculo para evitar hemorragia, pois o músculo formará um ponto de compressão. Mesmo camundongos com defeitos de hemostasia, como camundongos Itgb3-/-, não sangram após a inserção do cateter com essa abordagem.
- Remova suavemente a agulha e, se necessário, mova cuidadosamente o cateter mais fundo na veia. Conecte a seringa e estabilize o cateter adicionando uma gota de cola cirúrgica (Tabela de Materiais).
nota: É possível inserir um cateter dentro da veia da cauda, embora exija alguma prática porque a veia tem um calibre menor. Isso é especialmente difícil ao usar camundongos com cabelos escuros, cuja veia da cauda é pouco visível. Devido ao seu maior calibre, o posicionamento do cateter dentro da veia jugular pode permitir que volumes maiores ou tratamentos repetidos sejam injetados de forma mais confiável. Observe que a seringa é preenchida pela primeira vez com solução salina morna e não se esqueça de injetar o volume morto antes de injetar a solução do medicamento.
- Retorne o mouse com cuidado para a posição de bruços (Figura 1C). Aplique gel (Tabela de Materiais) nos olhos para evitar o ressecamento.
