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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Cirurgia e instalação do anel craniano
NOTA: O suporte total para instalação do mouse compreende 4 peças, um bloco e uma placa, o anel para segurar a cabeça do mouse e um parafuso para fixar o anel ao bloco (Figura 1A). Todos os elementos do suporte foram obtidos a partir de i.materialise.com por impressão 3D. A placa é feita de polímero de acrilonitrila butadieno estireno (ABS), o bloco e o parafuso de aço inoxidável e o anel de aço inoxidável de alta qualidade (aço inoxidável altamente detalhado) (consulte a Figura 2 para dimensões e materiais para os arquivos de impressão 3D). O bloco é fixado permanentemente ao suporte, aparafusado ou colado. Uma vez que o anel esteja fixado no crânio do rato, ele deve ser aparafusado ao suporte do bloco (Figura 1A).
- Umedeça os cabelos do couro cabeludo com uma toalha de papel umedecida com etanol 70% para desinfecção. Remova todos os cabelos soltos com uma toalha de papel molhada.
nota: Por conveniência, o couro cabeludo pode ser raspado antes da cirurgia.
- Incisar o couro cabeludo formando um T na linha média até 1 cm e entre as orelhas para expor a calvária usando tesouras finas e pinças estéreis.
nota: O anel será posicionado para sobrepor os ossos frontal e parietal (Figura 1B).
- Use uma pinça estéril para expor o crânio. Remova cuidadosamente o periósteo com tesoura e pinça. Use um cotonete estéril embebido em soro fisiológico para remover todo o periósteo e quaisquer detritos ou cabelos, que possam alterar a imagem.
nota: Para limitar as reações inflamatórias, tome muito cuidado para não danificar o osso.
- Remova quaisquer vestígios de sangue enxaguando com solução salina e seque rapidamente o osso com um cotonete seco. Aplique o gel de cola no anel, posicione-o no osso exposto e mantenha-o por alguns segundos para que o anel fique firmemente preso ao crânio.
nota: Nenhuma cola deve entrar no campo de observação, pois pode levar a uma autofluorescência indesejável.
- Umedeça levemente o crânio com um cotonete imerso em solução salina fisiológica.
- Prepare a pasta dental de silicone misturando cuidadosamente os componentes azul e amarelo 1:1. Aplique pasta dental em todo o anel para selar e evitar vazamentos durante a imagem. Remova cuidadosamente qualquer pasta ou cola dental que possa ter entrado no anel.
- Encha o anel com soro fisiológico e verifique se há vazamentos.
nota: A solução salina serve como meio de imersão para a objetiva do microscópio. O sangramento pode ser mais crítico ao usar camundongos com defeitos relacionados à hemostasia. É essencial evitar que o sangue entre no anel, pois pode embaçar outras imagens.
- Coloque o mouse no suporte e aparafuse o anel no suporte do bloco (Figura 1C). Coloque compressas dobradas sob a cabeça do animal para elevar a cabeça e evitar o desprendimento do anel do crânio.
nota: A cabeça é fixada diretamente para evitar movimentos de imagem devido à respiração.
- Posicione o suporte e o conjunto do mouse na câmara do microscópio aquecido (Figura 1D).
NOTA: Tenha cuidado para não desalojar o cateter inserido em nenhum momento.
