Imagem intravital: um método para observação em nível celular do pâncreas de camundongo através de uma janela de imagem estabilizada

Abstract

Fonte: Park, I. e Kim, P. Visualização longitudinal estabilizada em nível celular in vivo do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, descrevemos a imagem intravital do pâncreas de um camundongo através de uma janela estabilizada para visualização de longo prazo da dinâmica celular.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Imagem intravital

1. Ligue o microscópio intravital, incluindo a potência do laser.
2. Ligue a almofada de aquecimento e ajuste a regulação homeotérmica para 37 °C.
   nota: Como alternativa, use uma almofada ou lâmpada de aquecimento passivo com controle frequente se não houver regulação homeotérmica.
3. Pegue um mouse com janela pancreática pré-implantada. Realizar anestesia intramuscular com uma mistura de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
   nota: O uso de tiletamina/zolazepam é recomendado em vez de cetamina devido ao seu efeito adverso de hiperglicemia. A anestesia ideal deve ser selecionada para o propósito dos experimentos.
4. Insira um cateter vascular para a injeção.
   1. Aplique pressão no lado proximal da cauda com o indicador e o terceiro dedo como alternativa à aplicação de torniquete. Aqueça a cauda com uma lâmpada, se necessário.
   2. Esterilize a veia da cauda com um spray de etanol a 70%.
   3. Insira um cateter de 30 G na veia lateral da cauda. A regurgitação de sangue será visualizada no tubo PE10.
   4. Aplique uma fita de seda no cateter para estabilizá-lo.
   5. Injetar dextrana FITC/TMR ou outras sondas fluorescentes (25 μg de anti-CD31 conjugado com Alexa 647), conforme apropriado, de acordo com a combinação de sondas fluorescentes.
      nota: Para sondas de anticorpos conjugados fluorescentes, injete 2 h antes da sessão de imagem.
5. Transfira o mouse da plataforma cirúrgica para o estágio de imagem.
6. Insira uma sonda retal para controlar automaticamente a temperatura corporal com o sistema de almofada de aquecimento homeotérmico.
7. Insira a janela de imagem pancreática no suporte da janela preparado durante a configuração da microscopia intravital (Figura 1). Para um microscópio invertido, um suporte de janela pode não ser necessário.
8. Realize imagens intravitais.
   1. Para obter imagens do pâncreas, comece com uma lente objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 4x) para escanear toda a visão do pâncreas na janela de imagem pancreática (campo de visão recomendado: 2500 x 2500 μm).
   2. Após a determinação da região de interesse, mude para lente objetiva de maior ampliação (20x ou 40x) para realizar a imagem em nível celular (campo de visão recomendado: 500 x 500 μm ou 250 x 250 μm). Neste experimento, a resolução lateral e axial foi de aproximadamente 0,5 μm e 3 μm, respectivamente.
   3. Execute imagens de pilha z ou lapso de tempo para observar a estrutura 3D ou a dinâmica em nível celular, como migração de células.
      nota: Para imagens das células que expressam proteínas fluorescentes de animais transgênicos (MIP-GFP), 30 s de exposição intermitente ao laser de 488 nm com potência de até 0,43 mW foram toleráveis sem fotobranqueamento perceptível ou dano tecidual. Para imagens das proteínas fluorescentes marcadas com Alexa 647, a potência do laser de 640 nm de até 0,17 mW era tolerável sem fotobranqueamento perceptível ou danos aos tecidos. A exposição prolongada ao laser de excitação com uma potência acima dessa configuração pode levar ao fotobranqueamento ou danos aos tecidos por fototoxicidade. Ajuste o ganho e a potência adequados para obter imagens apropriadas da região de interesse. A definição detalhada dos parâmetros na microscopia intravital deve ser individualizada para cada microscopia intravital preparada no instituto.

Results

Figura 1: Fotografia da implementação da janela de imagem intravital pancreática.Uma janela de imagem intravital pancreática é implantada no camundongo no estágio translacional XYZ e o suporte da câmara de imagem conectado ao suporte basculante é conectado à janela de imagem pancreática. Direitos autorais 2020 Associação Coreana de Diabetes da Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Reproduzido com perm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ésteres Succinimidílicos Alexa Fluor 647 (ésteres NHS)	Invitrogen	A20006	Sonda fluorescente para conjugado com anticorpo
Tubulação de polietileno BD Intramedic	BD Biociências	427401	Cateter PE10 para conexão com agulha
C57BL/6N	OrientBio	C57BL/6N	C57BL/6N
Cobertura de vidros circular	Marienfeld	0111520	Vidro de cobertura para janela de imagem pancreática
FITC Dextran 2MDa	Merck (ex-Sigma Aldrich)	FD200S	Para identificação de embarcações
IMARIS 8.1	Plano de bits	IMARIS	Processamento de imagem
Microscopia Intravital	Tecnologia IVIM	IVM-C	Microscopia Intravital
MIP-GFP	O Laboratório Jackson	006864	B6. Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Janela de imagem pancreática	Geumto Engenharia	Pedido personalizado	Janela de imagem pancreática - pedido personalizado
Fisiosuíte	Kent Científico	PS-02	Controlador de temperatura homeotérmico
TMR Dextrano 65-85kDa	Merck (ex-Sigma Aldrich)	T1162	Para identificação de embarcações
Suporte para janela	Geumto Engenharia	Pedido personalizado	Suporte para janela - encomenda personalizada
Zoletil	Virbac	Zoletil 100	Agente anestésico
Rompun	Bayer	Rompun	Agente anestésico