Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Perfusão anterógrada do coração do camundongo
NOTA: A pipeta de transferência de plástico usada para sugar o coração deve ser macia e não ser acentuadamente afunilada em direção à ponta. Escolha uma pequena pinça vascular com serrilhado. Os instrumentos recomendados estão listados na Tabela de Materiais.
- Excisão do coração do camundongo e pinçamento da aorta
nota: Os camundongos adultos (>8 semanas de idade) devem ser sacrificados por uma overdose de pentobarbital sódico (>300 mg / kg, injeção intraperitoneal [i.p.]) com heparina (8000 unidade / kg).
- Extirpe o coração do rato rapidamente sugando.
- Abra a cavidade torácica rapidamente para expor o coração. Corte a pipeta de transferência de plástico, cuja ponta é aproximadamente do mesmo tamanho ou ligeiramente menor que o coração exposto (geralmente em um local a aproximadamente 1 cm da marca de 0,5 mL em direção à ponta, mas depende do tamanho do coração).
- Sugue o coração para dentro da pipeta, levante a pipeta para criar espaço suficiente para inserir a tesoura e excise o coração com uma tesoura curva do lado dorsal, evitando danificar os átrios.
- Transfira imediatamente o coração excisado para o copo de vidro de 30 mL contendo CIB-EGTA gelado para interromper a contração. Este procedimento geralmente leva <1 min.
- Limpeza ao redor da aorta
- Transfira o coração para uma placa de cultura de 35 mm cheia de CIB-EGTA gelada e remova o pulmão e outros tecidos visíveis e, em seguida, transfira o coração limpo grosseiramente para o suporte de coração cheio de CIB-EGTA resfriado e coloque-o com o ápice para baixo.
- Sob o microscópio estereoscópico, remova a gordura e os tecidos conjuntivos para limpar ao redor da aorta. Se o comprimento da aorta cortada for muito longo, incluindo a artéria braquiocefálica, a artéria carótida comum esquerda ou a artéria subclávia esquerda, corte a aorta logo abaixo da artéria braquiocefálica para encurtá-la e prosseguir para a próxima etapa. Este procedimento geralmente leva aproximadamente 4 minutos
- Pinçamento da aorta e colocação do coração pinçado na placa de perfusão
- Insira a agulha de injeção e inicie a perfusão para descarregar o sangue
- Sob o microscópio, coloque o coração no suporte do coração. O operador deve ficar de frente para a superfície anterior do coração, pegar a extremidade da aorta com uma pinça e prender a aorta perto dos átrios com uma pequena pinça vascular enquanto empurra suavemente a aorta um pouco para baixo.
- Coloque o coração clampeado na placa de perfusão com o lado anterior para cima e, em seguida, cubra-o com algumas gotas de CIB-EGTA para evitar que seque. Este procedimento geralmente leva <20 s.
- Perfusão anterógrada do coração
nota: Primeiro, perfunda o coração com CIB-EGTA para descarregar o sangue e prevenir a coagulação.
- Insira a agulha de injeção e inicie a perfusão para descarregar o sangue
- Coloque a seringa de 20 mL cheia de CIB-EGTA pré-aquecido conectada ao tubo de extensão flexível e uma agulha de injeção marcada na bomba de infusão. Ligue a bomba a uma taxa lenta de 0.5 mL/min para encher cuidadosamente a agulha e o tubo com CIB-EGTA e certifique-se de evitar que o ar entre no tubo.
- Coloque a agulha de injeção na placa de perfusão com o lado mais curto da forma diagonal à frente. Deslize a agulha em direção ao ápice do coração até tocá-lo e, em seguida, insira cuidadosamente a agulha perto do ápice do ventrículo esquerdo na câmara ventricular sem torcer. Não retire a agulha da placa durante a inserção.
- Observe a marca vermelha para estimar a profundidade da inserção da agulha. Quando a inserção da agulha é concluída, o sangue que flui da artéria coronária deve começar a ser descarregado.
- Fixe a agulha de injeção na placa com fita adesiva e aumente a velocidade da bomba para 1 mL/min. Este procedimento geralmente leva aproximadamente 30 s. Se o coração for perfundido com sucesso, o fluxo do CIB-EGTA no capilar logo abaixo do epicárdio pode ser visto ao microscópio.
