Fixação por pressão da valva pulmonar murina isolada: um procedimento para isolar e fixar quimicamente a valva pulmonar de camundongo em conformação fechada

Resumo

Fonte: Liu, Y., et al. Cirurgia e Processamento de Amostras para Imagens Correlativas da Válvula Pulmonar Murina. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, descrevemos o procedimento para isolar e fixar quimicamente o valor pulmonar do camundongo em conformação fechada por meio de pressurização de perfusão.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Excisão da valva pulmonar

1. Autoclave as ferramentas necessárias para a dissecção do mouse. Isso inclui tesouras finas, microfórceps, pinças microvasculares, pinças de aplicação de pinças, porta-microagulhas, tesouras de mola e afastadores.
2. Aclimate todos os camundongos por no mínimo 2 semanas antes da operação. Remova os camundongos C57BL / 6, com aproximadamente 1 ano de idade, de suas gaiolas e pese, depois eutanasiado com uma overdose de coquetel de cetamina / xilazina (3: 1 cetamina: xilazina, 0,01 mL por g).
3. Coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal em uma bandeja e prenda seus membros com fita adesiva. Uma vez seguro, execute a toracotomia.
   1. Exponha o coração removendo qualquer excesso de tecido adiposo e fáscia.
   2. Remova o átrio direito e perfunda através do ventrículo esquerdo com solução salina em temperatura ambiente (NaCl a 0,9%). A perfusão deve levar aproximadamente 20 mL ao longo de 30 s. Isso resulta na sangração do camundongo.
4. Remova todo o coração cortando a veia cava superior, a veia cava inferior, a artéria pulmonar e a aorta. Cuidados especiais devem ser tomados com a artéria pulmonar. Corte aproximadamente 2 mm acima da junção ventrículo-arterial, pois esta servirá como conduto para a pressurização.
5. Remova os ventrículos esquerdo e direito para expor as câmaras à pressão atmosférica. Certifique-se de que a estrutura do tronco pulmonar não seja afetada pela remoção dos ventrículos.

2. Fixação de pressão da valva pulmonar

1. Tubo de pressurização da anastomose com a artéria pulmonar, deixando aproximadamente 1 mm de distância entre a junção sinotubular e a extremidade do tubo para acomodar grandes movimentos dos folhetos e do tronco pulmonar.
2. Eleve o reservatório a uma pressão fisiológica análoga e encha-o com a solução salina. Teste o sistema de fluxo contínuo para garantir que não haja bloqueios ou bolhas de ar.
3. Conecte uma torneira à válvula pulmonar anastomosada e garanta o fluxo adequado através da tubulação (ou seja, sem bolhas de ar) trocando o trato de saída. Uma vez que o fluxo seja adequado, mude o fluxo de saída para a válvula pulmonar anastomosada e garanta a pressurização do tronco pulmonar. Isso é identificado pela distensão do tronco pulmonar.
4. Uma vez confirmada a pressurização do tronco pulmonar, incorporar gradualmente a solução fixadora primária (glutaraldeído a 1,25%, paraformaldeído a 1,0% em cacodilato 0,15 M) até que a solução salina seja purgada. Isso é feito retirando-se uma porção, aproximadamente 25% da capacidade do reservatório, da solução salina e substituindo-a pelo fixador primário.
   cuidado: Os fixadores utilizados (paraformaldeído e glutaraldeído) são altamente tóxicos e devem ser usados equipamentos de proteção individual (EPI) adequados para garantir a segurança.
5. Coloque uma gaze embebida em fixador sobre a amostra de tecido para evitar o ressecamento.
6. Perfundir o fixador por 3 h, reabastecendo o reservatório conforme necessário para manter uma pressão constante. Durante a fixação, não é incomum que a válvula pulmonar encolha por causa da fixação química. Se for esse o caso, reabasteça constantemente o reservatório com fixador primário para manter a pressão fisiológica.
7. Conservar a válvula cardíaca na solução fixadora a 4 °C até à utilização. As amostras foram armazenadas por até 1 semana sem qualquer diferença perceptível.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
25% de glutaraldeído (aq)	ems	Rolamento 16210	Componente fixador primário
Injeção de cloreto de sódio a 0,9%	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Seringa de 1 ml	Bd	309659
Seringa de 10 mL	Bd	309604
Agulha 22G	Bd	305156
Torneira de 3 vias	Smiths Medical ASD, Inc	MX5311L
4% de paraformaldeído (AQ)	ems	157-4-100	Componente fixador primário
Camundongos C57BL/6	Laboratórios Jackson	Episódio 664	Aproximadamente 1 ano
Pinça de aplicação de grampo	Festa	Nº 00072-14
Pinça Dumont #5	Festa	11251-20
Pinça Dumont #5/45	Festa	11251-35
Pinça fina Dumont #7	Festa	11274-20
Tesoura fina	Festa	14028-10
Solução salina (cloreto de sódio estéril a 0,9%)	Hospira Inc	NDC 0409-0138-22
Microscópio cirúrgico	Leica	M80
Porta-agulhas/pinça Tish	Micrins	MI1540
podão	Wahl	Rolamento 9854-500
Sutura monofilamentar de poliamida preta, 10-0	Corporação de instrumentos AROSurgical	TI38402
Sutura monofilamentar de poliamida preta, 6-0	Corporação de instrumentos AROSurgical	SN-1956
Injeção de cloridrato de cetamina	Hospira Inc	NDC 0409-2053
Ácido L-aspártico	Sigma-Aldrich	Rolamento 56-84-8	Componente de coloração
Nitrato de chumbo	ems	17900	Componente de coloração
Cacodilato de sódio tri-hidratado	Sigma-Aldrich	Nº 6131-99-3	buffer
Canções não tecidas	McKesson Corp.	Rolamento 94442000
Pinça micro-adson	Festa	11018-12
Filtro Millex-GP, 0,22 um, PES 33mm, não estéril	EMD Millipore	SLGP033NS