Coleção de depósito adiposo branco e marrom do filhote de rato: um procedimento cirúrgico para colher o tecido adiposo branco e o tecido adiposo marrom do filhote de camundongo

Neste artigo

Resumo

Fonte: Galmozzi, A. et al. Isolamento e diferenciação de pré-adipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos. Exp. (2021)

Neste vídeo, demonstramos o procedimento cirúrgico para isolar o tecido adiposo branco subcutâneo e o tecido adiposo marrom interescapular de um camundongo recém-nascido.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Coleta e digestão de depósitos adiposos (dia 1)

Prepare dois tubos de 1,5 mL para cada filhote: um para tecido adiposo marrom (BAT) e outro para tecido adiposo branco (TAB). Adicione 250 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) + 200 μL de tampão de isolamento 2x (123 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,3 mM de CaCl₂, 5 mM de glicose, 100 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), penicilina-estreptomicina e 4% de albumina de soro bovino livre de ácidos graxos) a cada tubo. Mantenha as soluções estéreis e no gelo.
Coloque os filhotes em pequenas câmaras (por exemplo, um poço de uma placa de 6 poços) e coloque-os no gelo até que fiquem hipotérmicos. Certifique-se de que não haja contato direto entre os filhotes e o gelo. Pique uma pata com uma ponta para garantir a perda de consciência e sacrificar os filhotes por decapitação usando uma tesoura afiada.
NOTA: se estiver trabalhando com genótipos diferentes, prepare um tubo adicional para coletar uma biópsia da cauda (corte de 3 mm) para genotipagem. Se a genotipagem for realizada imediatamente, mantenha os filhotes sacrificados no gelo até a dissecação para coletar os depósitos adiposos.
Calcule e pese a quantidade de colagenase necessária para digerir todos os depósitos. Adicione 50 μL de colagenase tipo I de 15 mg / mL em tampão de isolamento 2x a cada tubo. Não ressuspenda a colagenase em tampão isolado até que todos os tecidos tenham sido coletados.
Para coletar WAT subcutâneo, corte a pele ao redor do abdômen do filhote (evite a ruptura peritoneal) e puxe suavemente a pele para baixo abaixo das pernas. Sem retirar a pele, colete cuidadosamente o depósito de gordura, que aparecerá como um tecido fino e alongado claro (P1 ou mais jovem) ou branco (P2 e mais velho), preso na parte interna ou na parte superior do quadríceps (Figura 1A, B). Enxágue o depósito de gordura em PBS e coloque-o em um dos tubos contendo 250 μL de PBS + 200 μL de tampão de isolamento 2x. Mantenha o ice.
NOTA: Os camundongos P0 e P1 oferecem o melhor rendimento. Em filhotes P0-1, o depósito subcutâneo de WAT é quase transparente. Em camundongos P2 e mais velhos, o depósito é mais fácil de identificar porque já está ficando branco, indicando a presença de adipócitos brancos totalmente maduros e carregados de lipídios.
Para coletar o BAT interescapular, puxe a pele das omoplatas sobre a cabeça. Levante o BAT - o tecido vermelho profundo entre as omoplatas - e faça incisões cuidadosamente ao redor dele para separá-lo do corpo (Figura 1A, B). Verifique a consistência e a cor; enxágüe com PBS; colocá-lo no outro tubo contendo 250 μL de PBS + 200 μL de tampão de isolamento 2x; e continue no gelo.
NOTA: Ao colher BAT de camundongos P2 e mais velhos, remova cuidadosamente o tecido adiposo branco ao redor do BAT. Consiste em uma camada fina, macia e branca de adipócitos localizada entre a pele e o BAT, que é mais profunda entre as omoplatas.

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Resultados

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Figura 1: Coleta e processamento de almofadas de gordura. (A) Representação esquemática do isolamento primário de adipócitos brancos (superior) e marrons (inferiores). (B) Depósitos adiposos subcutâneos brancos (superior) e marrons (inferiores). Em camundongos P0, o WAT subcutâneo é quase invisível, mas torna-se distinguível em ~ dia 2 após o nascimento. Em contraste...