Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação do material e instrumentos
- Conecte a manta térmica para manter a temperatura da área de operação e a temperatura corporal do camundongo durante a anestesia a 37 °C.
- Tesouras e pinças de autoclave, prepare a solução de etanol a 70% e mantenha disponível pomada para os olhos de dexpantenol, vários pedaços de algodão e sutura de poliéster trançado revestido 5-0 pronto para uso. Prepare uma seringa de 1 mL com solução salina a 0,9% (sem agulha) para manter o local da incisão do animal hidratado. Prepare o gás anestésico (100% O2 + isoflurano).
- Prepare um suporte para a sonda Doppler laser cortando a ponta de uma ponta de pipeta de 10 μL (3-5 mm de comprimento).|
NOTA: Todos os instrumentos são esterilizados usando um esterilizador de esferas quentes. As superfícies também são desinfetadas antes e depois da cirurgia com um spray desinfetante microbiano. Antes da cirurgia, as áreas ao redor da cabeça e do peito dos camundongos são desinfetadas com um spray de desinfecção de feridas.
2. Preparação do laser Doppler
- Injete analgesia no camundongo 30 minutos antes da cirurgia (4 mg / kg de carprofeno e 0,1 mg / kg de buprenorfina, por via intraperitoneal).
- Anestesiar o camundongo colocando-o na câmara de indução com uma taxa de fluxo de isoflurano de 4% até a cessação do movimento espontâneo do corpo e das vibrissas.
- Coloque o mouse em decúbito ventral na área de operação com o nariz na máscara de anestesia. Mantenha a concentração de isoflurano em 4% por mais um minuto, depois reduza e mantenha em 2%.
- Defina a almofada de aquecimento controlada por feedback associada para manter a temperatura corporal do mouse em 37 °C e insira suavemente a sonda retal para monitorar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos.
- Aplique pomada de dexpantenol em ambos os olhos.
- Desinfete a pele e o cabelo ao redor do olho esquerdo e da orelha com etanol 70%.
- Corte o couro cabeludo entre a orelha esquerda e o olho (1 cm de comprimento) para expor o osso do crânio.
- Corte e retire o músculo temporal para visualizar a ACM abaixo do crânio.
- Fixe com cola a parte externa da ponta segurando a sonda / fibra Doppler a laser na parte superior do MCA esquerdo com cola. Em seguida, cole a pele para fechar a ferida ao redor do porta-pontas. Aplique 2-3 gotas de cola endurecedora para acelerar o processo. Certifique-se de que a fibra Doppler a laser não esteja colada e possa ser facilmente removida do suporte da ponta a qualquer momento.
3.Modelo MCAo transitório (oclusão)
- Vire o mouse para a posição supina. Coloque o focinho no cone de anestesia e fixe as patas com fita adesiva.
- Desinfete a pele e o cabelo ao redor do peito e faça uma incisão na linha média de 2 cm de comprimento no pescoço.
- Use uma pinça para separar a pele e as glândulas submandibulares. Use afastadores para segurar o músculo esternomastóideo, expor o campo cirúrgico e encontrar a artéria carótida comum esquerda (CCA). Dissecar o CCA livre de tecido conjuntivo e nervos circundantes (sem prejudicar o nervo vago) e realizar uma ligadura transitória antes da bifurcação.
- Disseque a artéria carótida externa (ECA) e dê um nó permanente na parte visível mais distal. Coloque outra sutura sob o ECA, próximo à bifurcação, e prepare um nó solto para ser usado posteriormente.
- Dissecar a artéria carótida interna (ACI) e colocar um clipe microvascular sobre ela, 5 mm acima da bifurcação. Certifique-se de não danificar o nervo vago.
- Faça um pequeno orifício no ECA entre as ligaduras apertadas e soltas; tome cuidado para não cortar todo o ECA.
- Introduza o filamento e avance-o em direção ao CCA. Aperte a ligadura frouxa no ECA ao redor do lúmen para prender brevemente o filamento nessa posição e evitar sangramento ao remover o clipe microvascular.
- Remova o clipe microvascular e insira o filamento através da ACI até que a origem da ACM seja alcançada, detectando uma redução acentuada (>80%) no fluxo sanguíneo cerebral medido pelo laser Doppler. Fixe o filamento nesta posição apertando ainda mais o nó ao redor do ECA.
nota: Quando o filamento vai na direção apropriada, ele avança suavemente e nenhuma resistência deve ser observada.
- Registre os valores do Doppler a laser antes e depois da inserção do filamento.
- Remova o afastador e reposicione o músculo esternomastóideo e as glândulas submandibulares antes de suturar a ferida. Retirar a sonda laser Doppler e colocar o animal numa câmara de recuperação a 37 °C durante 1 h (até à remoção do filamento).
