Modelo de ferida murina guiada por colonoscopia: um método para isolar o leito da ferida induzida por biópsia do cólon para entender o processo de cicatrização

Resumo

Fonte: Montrose, D. C., et al. Realização de biópsias de pinça guiadas por colonoscopia em camundongos e avaliação de alterações teciduais subsequentes. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para isolar o leito da ferida induzida por colonoscopia em um momento apropriado para análise molecular detalhada. Essa análise ajuda a entender o processo de cicatrização de feridas em condições inflamatórias do trato gastrointestinal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Coleta do leito da ferida para análise molecular

1. Eutanasiar camundongo usando asfixia por CO₂ seguida de luxação cervical (ou técnica equivalente) no dia selecionado após a biópsia.
2. Colha a região distal do cólon abrindo a pele e o músculo abdominal para expor a cavidade corporal. Coloque uma tesoura fechada sob o cólon e levante-a suavemente para liberá-la do mesentério subjacente e, em seguida, corte o cólon no meio e no ânus para removê-lo do mouse.
3. Lave o conteúdo fecal usando uma agulha de gavagem de rato conectada a uma seringa de 20 mL cheia de 1x PBS gelado e, em seguida, coloque o cólon em papel de filtro.
4. Corte o cólon longitudinalmente em papel de filtro, certificando-se de que o lado mesentérico esteja voltado para baixo contra o papel de filtro. Aplique azul de metileno a 0,2% na mucosa usando uma pipeta de compressão enquanto o tecido ainda estiver no papel de filtro e, em seguida, drene o excesso de azul de metileno. Visualize o cólon sob um microscópio de dissecação e localize o leito da ferida (Figura 1A).
5. Usando uma tesoura de microíris de 4 polegadas, corte ao redor da borda do leito da ferida (Figura 1A, círculo tracejado) tomando cuidado para não cortar a camada muscular (a menos que o músculo seja desejado) e transfira o leito da ferida dissecado para um tubo usando uma pinça de ponta fina para congelamento instantâneo ou método de armazenamento desejado.
   nota: A quantidade de tecido coletada dessa maneira é suficiente para extrair RNA para análise de RNA-seq ou equivalente.

Resultados

Figura 1: Imagens ex vivo e seccionadas do leito da ferida. (A) Um cólon foi colhido de um camundongo 2 dias após a biópsia, corado com azul de metileno a 0,2% e fotografado sob um microscópio de dissecação. O círculo tracejado indica as bordas do leito da ferida. A linha preta indica o local adequado para dividir o leito da ferida / cólon antes de incorporar para seccionamento. (B) Imagem representa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça de biópsia, 3 Fr	Karl Storz	61071ZJ
isofluorano	Covetrus	2905
azul de metileno	Sigma-Aldrich	M9140
tesoura micro íris	Integra	18-1619
Bisturi com lâmina #10	Hill-Rom	Rolamento 372610