Modelo de alça ileal de camundongo: um modelo cirúrgico para estudar a permeabilidade intestinal no camundongo

Resumo

Fonte: Boerner, K., et al. Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilos em Camundongos Usando um Modelo de Alça Intestinal Padronizado. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a geração de um modelo de alça ileal para estudar a permeabilidade intestinal em um modelo de camundongo. Este método fornece um modelo vivo para entender a função da barreira epitelial e a consequente resposta imune.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Geração da alça ileal

1. Preparo da pele: Esfregue o pelo da linha média abdominal com compressas embebidas em álcool ou gaze embebida em etanol 70%. Não molhe uma grande área de pêlo com álcool para evitar hipotermia.
2. Usando uma tesoura, execute uma laparotomia de linha média. Faça uma incisão vertical no meio do abdômen (cerca de 2 cm de comprimento) e exponha o peritônio. Tenha cuidado para não ferir os órgãos intra-abdominais.
3. Coloque gaze de algodão úmida pré-cortada sobre a cavidade intra-abdominal exposta.
4. Use cotonetes úmidos para mobilizar e exteriorizar o ceco. Coloque cuidadosamente o ceco sobre a gaze de algodão molhada.
   nota: O ceco está localizado no quadrante caudal esquerdo da cavidade abdominal na maioria dos camundongos, independentemente do sexo do animal.
5. Use cotonetes úmidos para mobilizar e exteriorizar suavemente o íleo do qual a seção terminal (extremidade distal) está presa ao ceco (Figura 1B).
6. Implante pelo menos 6 cm de íleo terminal na gaze de algodão úmida sem romper os vasos mesentéricos e o suprimento de sangue. O suprimento sanguíneo é mantido se não houver sangramento, e o tecido mantém sua cor rosada (Figura 1B).
   nota: Evite o ressecamento dos tecidos expostos, mantendo-os úmidos o tempo todo com HBSS quente (a cada 2 a 3 minutos) usando uma seringa de 10 mL pré-conectada a um tubo de alimentação amarelo.
7. Perto do ceco, identifique a artéria principal no mesentério, fornecendo sangue ao íleo. Em seguida, localize dois locais de ligadura no mesentério que estejam livres de vasos sanguíneos críticos.
8. Usando uma pinça de tecido rombudo, segure firmemente o íleo terminal (mais próximo do ceco) e, usando uma pinça de ponta fina, fenestre o mesentério evitando os vasos sanguíneos. Coloque a sutura de seda na perfuração e dê um nó cirúrgico para criar a primeira ligadura (extremidade distal da alça).
9. Use a régua para medir 4 cm de distância da primeira ligadura e crie a segunda ligadura (extremidade proximal do laço) conforme mencionado na etapa 2.8 (Figura 1C).
10. Com tesoura fina cortada cuidadosamente ao lado de cada ligadura para isolar a alça ileal de 4 cm, mantendo intacto o suprimento sanguíneo e a membrana mesentérica.
    nota: Corte ambas as extremidades do segmento exteriorizado do iLoop e, em seguida, lave suavemente como uma etapa necessária que evita a interferência com o conteúdo luminal (matéria fecal), facilitando assim a dispersão uniforme de FITC-dextrano ou estímulos quimiotáticos em todo o comprimento do segmento isolado, além de permitir uma quantificação mais precisa dos leucócitos por citometria de fluxo. Este procedimento também permite uma distensão uniforme da mucosa após a injeção de volumes especificados de reagente e melhor reprodutibilidade entre os animais.
11. Lave suavemente o conteúdo do segmento da alça ileal com HBSS quente usando um tubo de alimentação amarelo flexível conectado a uma seringa de 10 mL.
12. Ligue as duas extremidades cortadas da alça ileal lavada usando sutura de seda.
13. Use uma seringa de 1 mL com agulha de 30 G para injetar lentamente 250 μL de reagente, como FITC-dextrano ou quimiocina, no lúmen intestinal. A alça ileal inflará causando uma distensão moderada da mucosa (Figura 1D).
    nota: Injete o reagente no lúmen da alça no lado oposto da artéria mesentérica. Tenha cuidado para não retirar a alça ileal do animal durante a injeção para evitar romper os vasos sanguíneos e induzir sangramento.
14. Usando cotonetes úmidos, coloque suavemente de volta a alça ileal, o íleo proximal e o ceco.
15. Use um porta-agulha, pinça anatômica e pontos de seda 3.0 não absorvíveis com agulha de corte reverso para fechar a parede abdominal.
16. Coloque o animal em uma câmara de anestesia com temperatura regulada durante o período de incubação.

Resultados

Figura 1: O modelo de alça ileal. (A) Visão geral esquemática do modelo de alça ileal. A laparotomia mediana é realizada em camundongos sob anestesia e colocada em uma placa de cirurgia com temperatura controlada. (B) Exteriorização do ceco (*), íleo e mesentério. Dois locais adequados para ligadura são identificados (1,2). (C) Isole um segmento de 4 cm de comprimento: a primeira ligadura (1) é coloc...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento e Material
Cotonetes com álcool BD	Bd	326895
Agulha BD PrecisionGlide, 25G X 5/8"	Bd	305122
Agulha BD PrecisionGlide, 30G X 1/2"	Bd	305106
Seringa de tuberculina BD 1ml sem agulha	Bd	309659
Tubo de centrífuga de 15 ml	Corning	14-959-53UMA
Microplaca de Poliestireno Preto Sólido Corning 96-Well	FisherScientific	07-200-592
Prato de cultura não tratado Corning, 10cm	MilliporeSigma	CLS430588
Aplicador de ponta de algodão (cotonete), 6", estéril	FisherScientific	25806 2WC
Esponjas de Gaze de Algodão Dynarex, Não Estéril, 2" x 2"	Medex	3249-1
Vaporizador de anestesia EZ-7000 (Sistema Clássico, incluindo unidades de aquecimento)	Sistemas E-Z	EZ-7000
Moria Tesoura Fina	Festa	14370-22
Pomada Puralube Vet, Lubrificante Ocular Estéril	Dechra	12920060
Pinça de anel (pinça de tecido rombudo)	Festa	11103-09
Roboz Surgical 4-0 Seda Trançada Preta, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Pinça Semken (pinça anatômica)	Festa	1108-13
Sofsilk Não Absorvível Revestido Preto Sutura Trançada Seda Tamanho 3-0, 18", Agulha 19mm comprimento 3/8 círculo de corte reverso	HenrySchein	SS694
Fórceps Fino para Estudantes, Angulares	Festa	Rolamento 91110-10
Seringa de 10ml PP/PE sem agulha	Millipore Sigma	Z248029
Tubos de alimentação amarelos para roedores 20G x 30 mm	Instech	FTP-20-30
Soluções e buffers
Solução salina balanceada de Hanks	Corning	21-023-CV
Solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio	Corning	21-040-CV
Isoflurano	Halocarbono	12164-002-25