Geração do modelo de alça de cólon proximal de camundongo: um procedimento cirúrgico para gerar alça de cólon proximal e medir a permeabilidade intestinal pela detecção de marcadores fluorescentes no soro após injeção intraluminal

Resumo

Fonte: Boerner, K. et al. Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilos em Camundongos usando um Modelo de Alça Intestinal Padronizado. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, descrevemos um procedimento cirúrgico para gerar alça de cólon proximal de camundongo ou segmento pcLoop seguido de injeção intraluminal de marcadores fluorescentes no segmento para estudar a permeabilidade epitelial intestinal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Geração da alça do cólon proximal (pcLoop)

1. Preparo da pele: Esfregue o pelo da linha média abdominal com compressas embebidas em álcool ou gaze embebida em etanol 70%. Não molhe uma grande área de pêlo com álcool para evitar hipotermia.
2. Usando uma tesoura, execute uma laparotomia de linha média. Faça uma incisão vertical no meio do abdômen (cerca de 2 cm de comprimento) e exponha o peritônio. Tenha cuidado para não ferir os órgãos intra-abdominais.
3. Coloque gaze de algodão úmida pré-cortada sobre a cavidade intra-abdominal exposta.
4. Use cotonetes úmidos para mobilizar e exteriorizar o ceco. Coloque cuidadosamente o ceco sobre a gaze de algodão molhada.
   nota: O ceco está localizado no quadrante caudal esquerdo da cavidade abdominal na maioria dos camundongos, independentemente do sexo do animal.
5. Usando cotonetes úmidos, exteriorize todo o íleo e coloque-o em cima de uma gaze de algodão úmida. Identifique o cólon proximal e o suprimento sanguíneo localizado no mesocólon. Mobilize o cólon proximal e, usando uma pinça de ponta fina, crie a primeira ligadura em uma área livre de vasos no mesocólon a cerca de 0,5 cm distal do ceco (Figura 1B).
6. Meça 2 cm da primeira ligadura e crie uma segunda ligadura em uma área livre de suprimento sanguíneo no mesocólon (Figura 1C).
7. Usando uma tesoura fina, corte cuidadosamente ao lado de cada ligadura para isolar um pcLoop.
   de 2 cm de comprimento. nota: Com uma tesoura fina cuidadosamente cortada ao lado de cada ligadura para isolar a alça ileal de 4 cm, mantendo intacto o suprimento sanguíneo e a membrana mesentérica., é importante cortar ambas as extremidades para isolar um pcLoop que é suavemente limpo de conteúdo luminal. Corte cuidadosamente o tecido colônico e o mesocólon para evitar que pequenos vasos sangrem no lúmen intestinal. Se necessário, use cautério térmico para limitar o sangramento no local da incisão.
8. Lave suavemente o pcLoop com HBSS quente para remover as fezes usando um tubo de alimentação amarelo flexível conectado a uma seringa de 10 mL (prepare uma seringa de 10 mL cheia de HBSS quente e conecte a um tubo de alimentação amarelo. Esta seringa será usada para hidratar os tecidos expostos durante a cirurgia).
9. Ligue as duas extremidades cortadas do pcLoop lavado usando sutura de seda.
10. Use uma seringa de 1 mL com agulha 30G para injetar lentamente 200 μL de reagente, como FITC-dextrans (1 mg / mL em HBSS). Manter a solução de FITC-dextrano não utilizada protegida da luz para preparar a curva-padrão após a colheita do soro). O pcLoop inflará causando uma distensão moderada da mucosa (Figura 1D).
    nota: Injete o reagente no lúmen pcLoop no lado oposto da artéria mesentérica. Garanta a consistência entre os animais e crie um pcLoop de 2 cm de comprimento para garantir uma distensão igual da mucosa.
11. Utilize cotonetes úmidos para colocar suavemente de volta o pcLoop, o íleo e o ceco ligados na cavidade abdominal.
12. Use um porta-agulha, pinça anatômica e pontos de seda 3.0 não absorvíveis com agulha de corte reverso para fechar a parede abdominal.
13. Coloque o animal em uma câmara de anestesia com temperatura regulada durante o período de incubação.

Resultados

Figura 1: O modelo de alça de cólon proximal. (A) Visão geral esquemática do modelo pcLoop. A laparotomia mediana é realizada em camundongos sob anestesia colocados em uma placa cirúrgica com temperatura controlada. (B) Exteriorização do ceco (*), cólon proximal, mesocólon e íleo. Dois locais adequados para ligadura são identificados (1,2). (C) A pri...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento e Material
Cotonetes com álcool BD	Bd	326895
Seringa de tuberculina BD 1ml sem agulha	Bd	309659
Agulha BD PrecisionGlide, 25G X 5/8"	Bd	305122
Agulha BD PrecisionGlide, 30G X 1/2"	Bd	305106
Aplicador de ponta de algodão (cotonete), 6", estéril	FisherScientific	25806 2WC
Esponjas de Gaze de Algodão Dynarex, Não Estéril, 2" x 2"	Medex	3249-1
Vaporizador de anestesia EZ-7000 (Sistema Clássico, incluindo unidades de aquecimento)	Sistemas E-Z	EZ-7000
Kimwipes, pequenos (lenço de tecido)	FisherScientific	Telefone: 06-666
Moria Tesoura Fina	Festa	14370-22
Pomada Puralube Vet, Lubrificante Ocular Estéril	Dechra	12920060
Pinça de anel (pinça de tecido rombudo)	Festa	11103-09
Roboz Surgical 4-0 Seda Trançada Preta, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Pinça Semken (anatômica fórceps)	Festa	1108-13
Sofsilk Não Absorvível Revestido Preto Sutura Trançada Seda Tamanho 3-0, 18", Agulha 19mm comprimento 3/8 círculo de corte reverso	HenrySchein	SS694
Fórceps Fino para Estudantes, Angulares	Festa	Rolamento 91110-10
Seringa de 10ml PP/PE sem agulha	Millipore Sigma	Z248029
Reagentes
Isoflurano	Halocarbono	12164-002-25
Isotiocianato de fluoresceína-dextrano, peso molecular médio 4.000	sigma	Nº 60842-46-8