Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento do músculo EDL e digestão da colagenase
- Pulverize todos os equipamentos com etanol 70% para evitar contaminação.
- Sacrifique o rato de acordo com os regulamentos nacionais para experimentação animal.
- Pulverize os membros posteriores do camundongo com etanol a 70%. Use tesouras curvas finas endurecidas (ponta de 24 mm) e pinças finas (Dumont 7, curvas ou retas) para remover a pele e expor os músculos subjacentes. Evite qualquer contato dos músculos subjacentes com o pelo (aumenta o risco de contaminação).
- Remova a fáscia circundante com uma pinça curva fina sem danificar os músculos subjacentes (Figura 1A). Feche a pinça para evitar dobrar.
- Use uma pinça curva para expor os tendões distais do músculo TA (tibial anterior) e EDL. Para remover o TA, pegue o tendão distal do TA com uma pinça e corte com uma tesoura de mola Vannas fina (5 mm de ponta, 0,35 mm de diâmetro da ponta). Enquanto segura o TA no tendão, puxe-o em direção ao joelho e corte o músculo próximo ao joelho (Figura 1B), o músculo EDL agora está exposto.
nota: Certifique-se de que apenas o tendão TA seja agarrado nesta etapa, caso contrário, o EDL subjacente pode ser danificado. Ao cortar o músculo TA, certifique-se de que os tendões do joelho possam ser vistos facilmente depois.
- Levante o tendão distal do EDL com pinça curva fina e corte com tesoura de mola Vannas fina (Figura 1C). Exponha o tendão proximal do EDL puxando cuidadosamente o EDL em direção ao joelho. Corte o tendão proximal com uma tesoura de mola Vannas. Transfira o músculo EDL para 2,5 mL pré-aquecidos a 37 ° C de solução de digestão de colagenase, no tubo de reação de 15 mL. A solução de colagenase é preparada de acordo com este procedimento:
- Prepare a solução de digestão da colagenase dissolvendo a colagenase tipo 1 a 0,2% (p / v) (de Clostridium histolyticum) em DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco com 4,5 g / L de glicose e piruvato de sódio), filtre através de filtro de 0,22 μm. (Figura 1D).
nota: Faça uma pequena incisão no tecido conjuntivo externo do joelho para expor totalmente o tendão proximal do EDL. Certifique-se de agarrar apenas os tendões e não esticar muito o EDL.
- Repita as etapas 1.3. a 1.6 com o segundo EDL. Adicione os dois músculos EDL ao mesmo tubo de reação de 15 mL preenchido com 2,5 mL de solução de digestão de colagenase.
- Incubar os músculos EDL no tubo de reação a 37°C em banho-maria circulante.
nota: O tempo de incubação depende de vários fatores, como atividade da colagenase, idade do camundongo e quantidade de tecido fibrótico. O tempo típico de incubação para os músculos EDL de camundongos adultos (2-6 meses de idade) é de 1-1,5 h e para camundongos idosos (18 meses de idade) de 1,5-2 h.
- Para evitar a digestão excessiva dos músculos, verifique os músculos durante o tempo de digestão. Pare a digestão quando os músculos se soltarem e as miofibras individuais forem visíveis (Figura 1E). Transfira os músculos cuidadosamente com a pipeta de calibre grande para o primeiro poço da placa pré-aquecida de 12 poços contendo meio de isolamento de miofibra (Figura 1G), que é preparado da seguinte forma:
- Suplementar DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco com 4,5 g/L de glicose e piruvato de sódio) com 20% de FBS (soro fetal bovino), filtrar através de filtro de 0,22 μm. Adicione meio às placas de isolamento pré-revestidas (placa de 12 poços, 2-4 mL de meio de isolamento por poço) aproximadamente 30 min antes do isolamento e equilibre em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2.
2. Dissociação de miofibras
- Para as etapas seguintes, use um microscópio binocular estéreo, preferencialmente equipado com uma placa de aquecimento (37 °C). Use a pipeta de calibre grande para lavar os músculos com meio de isolamento quente até que as miofibras individuais sejam liberadas. Dissocie os músculos com a pipeta de grande calibre até que o número desejado de miofibras esteja flutuando livremente na solução.
nota: Evite trituração excessiva para reduzir o risco de miofibras danificadas. O uso de uma placa de aquecimento para dissociação de miofibras é fortemente recomendado, pois a temperatura cai durante o processo de isolamento, o que resultará na morte das miofibras.
