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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Agulhas de vidro estéreis
- Ligue o extrator de pipeta de agulha.
- Ajuste o botão Aquecedor até que o visor mostre 12.6.
- Abra a porta e alimente manualmente o tubo capilar de 5 μL através do clamp superior e filamento do aquecedor até que metade do tubo se estenda abaixo do filamento (Figura 1A).
- Confirme se o tubo capilar está na ranhura em "V" no grampo superior. Aperte o grampo superior.
- Com o grampo inferior aberto, ajuste manualmente o deslizamento vertical para cima até que o grampo inferior atinja seu limite superior. Confirme se o tubo está na ranhura em "V" no grampo inferior. Aperte o grampo inferior.
- Feche a porta e confirme se a luz 'Pronto' está acesa. Pressione o botão Iniciar para iniciar o aquecedor e a sequência de tração (Figura 1B).
- Certifique-se de que o aquecedor desligue automaticamente depois que o calor e a gravidade separarem o tubo capilar (Figura 1C) e a corrediça se mover para baixo.
- Abra a porta. Enquanto segura a parte superior do tubo capilar, desaperte a parte superior clamp. Remova o tubo capilar superior e reserve.
- Segure o tubo capilar na corrediça inferior e desaperte o grampo inferior. Remova o tubo capilar inferior e reserve.
- Use um chanfrador de microeletrodo com uma placa de moagem abrasiva de alumina de 0,05 μm para chanfrar o tubo capilar puxado para criar as agulhas de injeção.
- Pipete água suficiente na placa de moagem para cobrir a superfície (Figura 1D).
- Ligue o chanfrador para que ele comece a girar a 60 rpm. Coloque o tubo capilar puxado na pipeta clamp na ranhura em "V". Aperte o clamp e ajuste o ângulo do clamp da pipeta para 30°.
- Ajuste a ponta da borda pontiaguda do tubo capilar a aproximadamente dois terços de distância do centro de rotação da placa de moagem.
- Abaixe o tubo capilar clamped ajustando o botão de controle grosso na parte superior do manipulador. Continue a abaixar o tubo capilar até que a ponta do tubo capilar se estenda abaixo da superfície da água e entre em contato com a superfície abrasiva da placa de moagem.
- Monitore o progresso do chanfro usando o microscópio conectado ao chanfro. Após 5 min, ajuste o controle fino para levantar a agulha de vidro da placa de moagem.
- Remova a agulha de vidro e coloque-a sob uma ampliação de 10x para verificar a ponta do tubo capilar (Figura 1E, F).
- Para garantir que não haja bloqueios, insira a agulha de vidro em um porta-pipetas em uma seringa e empurre o ar para um tubo de 1 mL de etanol a 99%. Se bolhas de ar se formarem na ponta da agulha, a agulha não terá bloqueios e poderá ser usada para microinjeção. Este processo também garante a esterilidade das agulhas de vidro.
- Um tubo capilar pode conter até 5 μL de fluido. Marque o tubo capilar em 10 seções para calcular as distâncias na agulha a serem marcadas para volumes de 0,5 μL. Marque uma escala com essa distância que contenha 0,5 μL para preparação futura. Para uma agulha de 5 μL, distâncias de 0,7 mm de distância equivalem a 0,5 μL (Figura 1G).
2. Injeção intravítrea em camundongo
- Execute todos os procedimentos desta seção sob condições de Nível de Biossegurança 2.
- Prepare o local do procedimento colocando almofadas médicas na mesa de operação.
- Ligue o microinjetor e abra a válvula de gás no tanque de ar comprimido conectado ao microinjetor. Ajuste o regulador do tanque até que o fornecimento de gás seja de aproximadamente 60 psi.
- No microinjetor, pressione Modo até que a tela mostre Equilíbrio. Pressione Balance e coloque o mouse do computador na mesa de operação. Conecte o porta-pipetas de aço inoxidável ao tubo conectado a 'Fill/Output' do injetor. Este tubo está sempre conectado ao injetor.
- Insira a agulha capilar na outra extremidade do porta-pipetas apertando o conector do porta-pipetas ao redor da agulha.
- Ligue o microscópio oftálmico e acenda sua luz a uma intensidade de 50%. Ajuste o microscópio sobre o local do procedimento na mesa de operação e ajuste o microscópio para o foco desejado.
- Antes do início do procedimento, confirme se o mouse está adequadamente anestesiado, testando o reflexo de retirada do pedal. Certifique-se de seguir o protocolo aprovado pela IACUC para anestesia.
- Coloque o mouse anestesiado nas almofadas médicas com o nariz apontado para a direita e inclinado para o lado esquerdo.
- Olhe para o olho direito do camundongo através do microscópio oftálmico e abra as pálpebras abrindo as pinças de uma pinça de ação reversa em ambos os lados do olho para expor o local da injeção (Figura 2C).
- Encha a agulha capilar com a solução bacteriana de Bacillus cereus (ATCC 14579) (diluição de 200 UFC/μL) clicando com o botão esquerdo no mouse pad conectado ao microinjetor (Figura 2D).
- Prenda a cabeça do animal com a mão esquerda e coloque a ponta da agulha no limbo do olho. Com a agulha na posição de bisel e num ângulo de 45°, perfure o olho do rato, mas certifique-se de que apenas a ponta afiada da agulha (~0,5 mm) é inserida durante a injeção.
- Assim que a ponta da agulha for inserida, mova a mão esquerda da cabeça do mouse para o mouse pad e clique com o botão direito do mouse pad para injetar 0,5 μL da diluição de B. cereus preparada em caldo Brain Heart Infusion (BHI). Para evitar vazamentos, deixe a ponta da agulha dentro do olho do mouse por 2-3 segundos antes de removê-la (Figura 2E).
- Solte a pinça e coloque o mouse em uma gaiola que está sobre uma almofada de aquecimento. Monitore esses camundongos até que eles se recuperem da anestesia (Figura 2F).
- Assim que os camundongos estiverem recuperados da anestesia, retorne a gaiola ao seu rack adequado. Se os camundongos forem submetidos à análise da função retiniana por eletrorretinografia, as gaiolas devem ser devolvidas a uma sala escura para adaptação adequada ao escuro.
