Ensaio de Quantificação de Infecção Bacteriana: Um Método para Quantificar a Carga Bacteriana Intraocular em Modelo de Endoftalmite Bacteriana em Camundongo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação do tubo de colheita

1. Coloque esferas de vidro estéreis de 1 mm em tubos com tampa de rosca de 1.5 mL.
2. Esterilize esses tubos em uma autoclave em um ambiente seco. Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente antes de usar.
3. Adicione 10 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.
4. Adicione 1 comprimido de coquetel inibidor de protease no tubo. Misture por vórtice.
5. Pipete 400 μL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo inibidor de protease em cada tubo de colheita autoclavado. Rotule os tubos e coloque no gelo. (Figura 1A).

2. Colhendo os olhos

1. Execute todos os procedimentos desta seção sob condições de Nível de Biossegurança 2.
2. Eutanásia do camundongo por inalação de CO₂. Use um método secundário para confirmar a eutanásia.
3. Segure a cabeça do rato eutanasiada com segurança e abra a pinça de ponta fina em ambos os lados do olho infectado. Empurre para baixo em direção à cabeça para proptose o olho. Quando as pinças estiverem atrás do globo ocular, aperte-as. Afaste a pinça da cabeça para destacar o globo ocular (Figura 1B).
4. Coloque imediatamente o globo ocular em um tubo de colheita rotulado. Coloque os tubos no gelo por no máximo 60 min (Figura 1C).

3. Contagem bacteriana intraocular

1. Execute todos os procedimentos desta seção sob condições de Nível de Biossegurança 2.
2. Confirme se todos os tubos de colheita estão bem fechados e equilibrados enquanto estiverem no homogeneizador de tecidos (Figura 2A). Ligue o homogeneizador de tecidos por 1 min para homogeneizar as amostras. Aguarde 30 s e ligue por mais um minuto. Coloque os tubos no gelo (Figura 2B, C).
3. Dilua em série cada amostra 10 vezes, transferindo sequencialmente 20 μL do homogenato para 180 μL de PBS 1x estéril. Diluir até atingir um fator de ^10-7 (Figura 2D).
4. Rotular cada linha de uma placa BHI quadrada e quente com os fatores de diluição adequados. Transferir 10 μL de cada diluição seguida para a placa BHI superior inclinada aproximadamente 45°. Deixe a amostra escorrer até quase atingir o fundo da placa e, em seguida, coloque a placa plana (Figura 2E).
5. Quando a amostra for absorvida pelo ágar BHI, transferir a placa para uma incubadora a 37 °C. As colônias devem começar a ser visíveis 8 h após serem colocadas na incubadora.
6. Remova a placa da incubadora antes que o crescimento das colônias de B. cereus interfira na identificação de colônias individuais (Figura 2F).
7. Para uma representação precisa da concentração na amostra, conte a linha que tem entre 10 e 100 colônias. Por exemplo, uma linha com a fração de diluição de ^10-4 que tem 45 colônias terá uma concentração de 4,5 x 10⁵ UFC/mL.
8. Para calcular o número total de bactérias por olho, multiplique a concentração por 0,4, que representa o volume mililitro de 1x PBS usado para homogeneizar o olho. Por exemplo, a concentração de 4,5 x 10⁵ UFC/mL se traduziria em 1,8 x 10⁵ UFC B. cereus por olho.

Figura 1: Colheita de olho infectado de camundongo. Após a infecção, após o ponto de tempo desejado, colha os olhos de camundongo infectados usando uma pinça estéril. (A) PBS contendo contas de vidro estéreis. (B) Colheita do olho infectado. (C) Tubo de colheita contendo um olho de camundongo.

Figura 2: Processando o olho colhido para contagem bacteriana intraocular. (A) Tubo de colheita com o olho infectado firmemente preso a um homogeneizador de tecido. (B) Os olhos infectados foram homogeneizados duas vezes por 1 min cada. Diluição de pista (D) dos homogeneizados oculares (C) e subsequente plaqueamento (E) para a quantificação bacteriana. (E) Colônia individual representativa de Bacillus cereus após diluição do rastreamento.