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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação do tubo de colheita
- Coloque esferas de vidro estéreis de 1 mm em tubos com tampa de rosca de 1.5 mL.
- Esterilize esses tubos em uma autoclave em um ambiente seco. Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente antes de usar.
- Adicione 10 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.
- Adicione 1 comprimido de coquetel inibidor de protease no tubo. Misture por vórtice.
- Pipete 400 μL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo inibidor de protease em cada tubo de colheita autoclavado. Rotule os tubos e coloque no gelo. (Figura 1A).
2. Colhendo os olhos
- Execute todos os procedimentos desta seção sob condições de Nível de Biossegurança 2.
- Eutanásia do camundongo por inalação de CO2. Use um método secundário para confirmar a eutanásia.
- Segure a cabeça do rato eutanasiada com segurança e abra a pinça de ponta fina em ambos os lados do olho infectado. Empurre para baixo em direção à cabeça para proptose o olho. Quando as pinças estiverem atrás do globo ocular, aperte-as. Afaste a pinça da cabeça para destacar o globo ocular (Figura 1B).
- Coloque imediatamente o globo ocular em um tubo de colheita rotulado. Coloque os tubos no gelo por no máximo 60 min (Figura 1C).
3. Contagem bacteriana intraocular
- Execute todos os procedimentos desta seção sob condições de Nível de Biossegurança 2.
- Confirme se todos os tubos de colheita estão bem fechados e equilibrados enquanto estiverem no homogeneizador de tecidos (Figura 2A). Ligue o homogeneizador de tecidos por 1 min para homogeneizar as amostras. Aguarde 30 s e ligue por mais um minuto. Coloque os tubos no gelo (Figura 2B, C).
- Dilua em série cada amostra 10 vezes, transferindo sequencialmente 20 μL do homogenato para 180 μL de PBS 1x estéril. Diluir até atingir um fator de 10-7 (Figura 2D).
- Rotular cada linha de uma placa BHI quadrada e quente com os fatores de diluição adequados. Transferir 10 μL de cada diluição seguida para a placa BHI superior inclinada aproximadamente 45°. Deixe a amostra escorrer até quase atingir o fundo da placa e, em seguida, coloque a placa plana (Figura 2E).
- Quando a amostra for absorvida pelo ágar BHI, transferir a placa para uma incubadora a 37 °C. As colônias devem começar a ser visíveis 8 h após serem colocadas na incubadora.
- Remova a placa da incubadora antes que o crescimento das colônias de B. cereus interfira na identificação de colônias individuais (Figura 2F).
- Para uma representação precisa da concentração na amostra, conte a linha que tem entre 10 e 100 colônias. Por exemplo, uma linha com a fração de diluição de 10-4 que tem 45 colônias terá uma concentração de 4,5 x 105 UFC/mL.
- Para calcular o número total de bactérias por olho, multiplique a concentração por 0,4, que representa o volume mililitro de 1x PBS usado para homogeneizar o olho. Por exemplo, a concentração de 4,5 x 105 UFC/mL se traduziria em 1,8 x 105 UFC B. cereus por olho.
