Perfusão Pulmonar Ex vivo: Uma Técnica para Pesquisa Pulmonar em Modelo de Coelho

Resumo

Fonte: Pacheco-Baltazar, A., et al., Sistema de Perfusão Pulmonar Isolada no Modelo de Coelho. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo mostra uma técnica ex vivo para perfusão pulmonar isolada. É uma ferramenta para pesquisa pulmonar que auxiliará no estudo de vários mecanismos fisiológicos e patológicos envolvidos nos procedimentos de transplante pulmonar.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Canulação:

1. Coloque os pulmões do coelho recém-isolado junto com o coração sobre uma gaze estéril em uma placa de Petri.
2. Para evitar atelectasias, ventile os pulmões usando ventilação com pressão positiva com pressão expiratória final positiva (PEEP) ajustada em 2 cmH₂O.
3. Remova os ventrículos cortando-os do coração ao nível do sulco atrioventricular.
4. Depois de abrir os dois ventrículos, introduza a cânula da artéria pulmonar OD 4,6 mm para o coelho com uma cesta através da artéria pulmonar e introduza a cânula OD 5,9 mm do átrio esquerdo para o coelho com a cesta através da válvula mitral no átrio esquerdo.
5. Use uma sutura de seda 4-0 na artéria pulmonar e no átrio esquerdo para fixar as cânulas. Inclua os tecidos circundantes nas ligaduras da artéria pulmonar e do átrio esquerdo para evitar a distensão dessas estruturas.
6. Injete 250 mL de solução isotônica salina através das cânulas arteriais para liberar o sangue restante do leito vascular.

2. Técnica de perfusão:

1. configuração:
   1. Coloque os pulmões isolados cuidadosamente na câmara pulmonar.
   2. Conecte a traqueia ao transdutor na tampa da câmara.
   3. Conecte os vasos canulados ao sistema de perfusão.
   4. Feche a câmara e prenda-a com a trava rotativa.
      nota: O circuito de perfusão de recirculação consiste em um reservatório venoso aberto, uma bomba peristáltica, um trocador de calor e uma armadilha de bolhas.
   5. Neste ponto, coloque a tampa da câmara e mude uma torneira para mudar da ventilação com pressão positiva para negativa. Para verificar a ventilação com pressão negativa dos pulmões e o fechamento hermético da câmara, inspecione a excursão respiratória do pulmão e a pressão da câmara no manômetro.
   6. Perfundir os pulmões com 200 mL de perfusato artificial sem sangue (um tampão de bicarbonato Krebs-Ringer contendo 2,5% de albumina bovina).
   7. Inicie o fluxo de perfusato a 3 mL / min / kg e, em seguida, aumente lentamente o fluxo em um período de 5 minutos para 5 mL / min / kg. Atingir um fluxo de 8 mL/min/kg nos próximos 5 min e, após outro período de 5 min, atingir um fluxo máximo de 10 mL/min/kg. Tome cuidado para evitar que o ar entre no circuito.
      nota: Manter o pH e a temperatura do perfusato dentro de faixas fisiológicas (pH 7,4-7,5; temperatura, 37 °C-38 °C). Para ajustar o pH, adicione NaHCO₃ (1N) ou aumente o fluxo de dióxido de carbono. Alternativamente, use HCl (0,1N) para acidificar.
2. Parâmetros:
   1. Verifique se os parâmetros predeterminados de perfusão e ventilação estão definidos conforme necessário.
   2. Ventilar os pulmões com ar umidificado a uma frequência de 30 bpm, um volume corrente de 10 mL/kg e uma pressão expiratória final (Pe) de 2 cmH₂O.
      nota: A pressão arterial pulmonar (0-20 mmHg) corresponde à altura do nível de líquido no oxigenador ou reservatório em centímetros acima do tronco pulmonar, enquanto a pressão venosa pulmonar corresponde à altura da câmara de equilíbrio de pressão acima do átrio esquerdo. Ambos os valores podem ser modificados. Observe que a pressão do átrio esquerdo também é de 0-20 mmHg.
3. Alcançando as condições da zona 3:
   1. Use os dois cateteres conectados às portas laterais das cânulas presas na artéria pulmonar, átrio esquerdo e transdutores de pressão para medir as pressões arterial (Pa) e venosa (Pv).
   2. Defina as pressões basais ao nível do hilo pulmonar (referência zero).
   3. Conduza os experimentos em condições de ventilação da zona 3. Para conseguir isso, espere de 10 a 15 minutos para obter um equilíbrio caracterizado por um estado isogravimétrico.
   4. Certifique-se de que a pressão venosa seja maior que a pressão alveolar (Palv) e a pressão arterial permaneça mais alta que ambas (Pa > Pv > Palv) para que ocorram condições da Zona 3.
   5. Certifique-se de que o peso dos pulmões permaneça constante e as pressões arterial e atrial esquerda sejam estáveis para atingir as condições da zona 3 para abrir um número máximo de vasos pulmonares e manter o conteúdo do leito microvascular durante o experimento.
      nota: A medida do Kfc como indicador de edema pulmonar não tem variação entre um sistema de perfusão manual e automático.
4. Controle eletrônico e processamento de sinais: Garantir que o fluxo respiratório, as mudanças de peso, a pressão microvascular, o volume corrente, a resistência vascular, entre outros, sejam registrados em uma unidade eletrônica central múltipla que integra os sinais provenientes dos transdutores e os exibe no sistema de avaliação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo Tygon E-Lab de 2 paradas, 3,17 mm de diâmetro, 12/pacote, preto/branco	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adaptador para ventilação com pressão positiva no IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-4312
Adaptador para ventilação com pressão positiva no IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-4312
Fornecimento alternativo de gás sem pressão para IPL-4: Para fornecer à traqueia uma mistura de gases diferente do ar ambiente durante a ventilação negativa	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-4309
Unidade Base para o Pulmão Perfundido Isolado de Coelho para Porco Fetal	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-4138
Soro bovino A2: D41albumina liofilizada em pó	sigma	3912	500 gramas
Cloreto de cálcio, CaCl2·2H2O.	JT Baker	10035-04-8
Frascos criogênicos	Corning	430659	2 mL
D-glicose, C6H12O6	sigma	G5767
Transdutor diferencial de baixa pressão DLP2.5, faixa +- 2,5 cmH2O, conector HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Transdutor de Pressão Diferencial MPX, Faixa +- 100 cmH2O, Conector HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nº 73-0064
Tubos Eppendorf
Etanol absoluto para HPLC	Caledon
Tubos de falcão			14 mL
Bomba peristáltica Harvard P-230 (completa com caixa de controle e acionamento do motor P-230)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Pneumotacômetro Linear Aquecido Faixa de fluxo de 0 a 10 L/min	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 59-9349
Controlador de aquecedor para pneumotacômetro único 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Rolamento 59-9703
heparina	Pisa		5000 UI
Coluna de HPLC (C18 100A 5U)	Alltech	98121213	150 mm x 4,6 mm
Filtro de seringa hidrofílica	Millex	SLLGR04NL	4 milímetros
Sistema de núcleo IPL-4 para coelho isolado ao pulmão fetal do porco, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-4296
Sistema de núcleo IPL-4 para coelho isolado para pulmão fetal de porco, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-4296
Reservatório de vidro encamisado para solução tampão, com fritas e tubos, 6,0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Rolamento 73-0322
Termostático Lauda Circulador, Tipo E-103, 230 V/50 Hz, Volume de Banho de 3 L, Faixa de Temperatura 20 a 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-0125
Cânula de átrio esquerdo para coelho com cesto, OD 5,9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nº 73-4162
Transdutor de pressão arterial de faixa baixa P75 para módulo PLUGSYS	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Pedido 73-0020
Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4·7H2O	JT Baker	10034-99-8
Tubo de microcentrífuga	Corning	430909
Opção de controle de ventilação de pressão negativa com regulador de pressão para IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-4298
Coelhos da Nova Zelândia
PISABENTAL (Pentobarbital sódico)	Pisa	Pergunta 7833-215
Estojo PLUGSYS, Tipo 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-0045
Módulo contador de tempo PLUGSYS TCM	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
Módulo amplificador de transdutor PLUGSYS (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Pedido 73-0065
Módulo Amplificador Transdutor PLUGSYS (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
Módulo de Controle de Ventilação PLUGSYS VCM-4R com Regulador de Pressão	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
Cloreto de potássio, KCl.	JT Baker	3040-01
Di-hidrogenofosfato de potássio, KH2PO4	JT Baker	Rolamento 7778-77-0
Cânula de Artéria Pulmonar para Coelho com Cesto, OD 4,6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-4161
Servo Controlador para Perfusão (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Telefone: 73-2806
Tubo de microcentrífuga Snap Cap	Costar	3620	1,7 mL
Bicarbonato de sódio, NaHCO3	sigma	S6014
cloreto de sódio, NaCl	sigma	S9888
Luvas cirúrgicas nº 7 1/2
Luvas cirúrgicas nº 8
Tubos de Taygon	Masterflex
Cânula Traqueal para Coelho, OD 5,0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Rolamento 73-4163