Preparando o Modelo de Coelho Consciente para Vídeo-EEG-ECG-Oximetria-Capnografia Simultânea para Intervenções Experimentais: Um Procedimento para Implantar Eletrodos de EEE-ECG e Anexar Sondas Respiratórias em Modelo de Coelho

Resumo

Fonte: Bosinski, C. et al., Monitoramento multissistema para identificação de convulsões, arritmias e apneia em coelhos contidos conscientes. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra o procedimento para implantar eletrodos de EEG-ECG e anexar sondas respiratórias em um modelo de coelho para aquisição e análise de registros de seus biosinais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Implante de eletrodos de EEG-ECG e conexão de monitores respiratórios

1. Remova um coelho da transportadora e coloque-o no colo de um investigador sentado.
2. Segure o coelho verticalmente e mantenha-o próximo ao corpo do investigador.
3. Abaixe o coelho em decúbito dorsal, com a cabeça do coelho nos joelhos do investigador e a cabeça do coelho mais baixa do que o resto do corpo.
   nota: Essa manobra relaxa o animal e minimiza a probabilidade de ele tentar se mover ou escapar enquanto coloca os eletrodos.
4. Agora que o coelho está preso em decúbito dorsal, peça a um segundo investigador para espalhar o pelo até que a pele possa ser identificada e isolada do tecido subjacente.
5. Insira eletrodos dobrados a 35° por via subdérmica em cada axila (Figura 1A).
   nota: Os eletrodos devem ser empurrados para que fiquem firmemente presos à pele, mas não penetrem em estruturas mais profundas. Fazer com que o eletrodo entre e saia da pele (completamente) reduz a chance de os eletrodos se soltarem ao colocar o coelho na contenção ou se ele se mover durante o experimento (Figura 1B). Todos os eletrodos são esterilizados com etanol a 70% antes da colocação.
6. Coloque eletrodos no tórax posterior aos membros anteriores direito e esquerdo e no abdômen anterior ao membro posterior esquerdo. Coloque um eletrodo de aterramento anterior ao membro posterior direito no abdômen (Figura 2A).
7. Uma vez que todos os eletrodos de ECG estejam colocados corretamente, retorne o coelho para uma posição de bruços, com os eletrodos subindo por um lado do abdômen do coelho, e transfira o coelho para um limitador de tamanho apropriado (por exemplo, 6 "x 18" x 6 "). Ao colocar o coelho no sistema de contenção, puxe o fio solto para cima para minimizar que o coelho puxe os eletrodos com as pernas. Prenda os fios na lateral do limitador para que não fiquem presos sob o coelho durante o experimento (Figura 2B).
8. Prenda o coelho no sistema de retenção abaixando a restrição ao redor do pescoço e travando-a no lugar. Além disso, mova os membros posteriores para baixo do animal e prenda o sistema de retenção traseiro.
   nota: Deve-se ser capaz de encaixar 1-2 dedos no espaço sob o pescoço para garantir que não fique muito apertado. Particularmente durante experimentos em que pode haver movimento motor, é importante apertar a restrição para minimizar o movimento, possíveis lesões na coluna vertebral, luxação de membros e a capacidade de chutar a restrição traseira (Figura 2B). Os coelhos foram mantidos no sistema de retenção por ~ 5 h sem problemas relacionados ao aumento do movimento ou sinais de desidratação.
   1. Para coelhos pequenos (por exemplo, menos de 2 meses), coloque uma almofada de borracha sob o animal para levantá-lo, o que evita que o coelho descanse o pescoço na parte inferior do encosto de cabeça (Figura 2C).
      nota: Uma queda repentina na frequência respiratória e cardíaca pode ser secundária ao impacto do pescoço. Se isso ocorrer, afrouxe o limitador do pescoço e levante a cabeça do coelho para aliviar qualquer compressão do pescoço.
   2. Quando a restrição traseira não traçar de perto as costas/coluna do coelho, coloque um espaçador de PVC para evitar qualquer movimento que possa causar lesões na coluna.
      nota: Por exemplo, tubo de PVC de ~ 14 cm de comprimento x 4 "de diâmetro interno, com os 25-33% inferiores removidos, pode ser colocado sobre o coelho com espuma para fornecer a contenção apropriada (Figura 2C).
9. Agora que o coelho está firmemente colocado no sistema de contenção, insira os eletrodos retos subdérmicos de 7-13 mm no couro cabeludo (Figura 1A). Usando uma abordagem de ângulo de entrada de 45°, passe os fios entre as orelhas e amarre frouxamente os fios ao limitador atrás da cabeça para manter a colocação do eletrodo. Posicione 5 derivações de EEG nas seguintes posições: anterior direita, anterior esquerda, occipital direita, occipital esquerda e uma derivação de referência central (Cz) no ponto entre as outras 4 derivações (Figura 2D).
   nota: Os eletrodos são colocados corretamente quando posicionados no tecido subcutâneo contra o crânio. Esse posicionamento minimiza o artefato do nariz, orelhas e outros músculos circundantes. Algum artefato do movimento rítmico do nariz é inevitável. As derivações anteriores do EEG devem ser colocadas medialmente aos olhos do coelho e apontadas anteriormente. Os eletrodos occipitais devem ser colocados anteriormente às orelhas e apontarão na direção medial. Cz é colocado no centro do topo da cabeça em um ponto que fica entre todos os 4 eletrodos (a meio caminho entre Lambda e Bregma, ao longo da linha de sutura). O pino do eletrodo Cz aponta anteriormente.
   1. Passe os fios de EEG entre as orelhas, para evitar que o coelho tente morder os fios.
10. Conecte o pletismógrafo do oxímetro de pulso à orelha do coelho sobre a veia marginal da orelha.
    nota: Pode ser necessário raspar o excesso de pelos da orelha para melhorar o sinal ou usar um pouco de gaze para manter o sensor no lugar.
    1. Certifique-se de que a frequência cardíaca na pletismografia esteja correlacionada com a frequência cardíaca do ECG e que a saturação de oxigênio seja exibida (Figura 3C).
11. Coloque suavemente a máscara facial com tubo de capnografia sobre a boca e o nariz do coelho (Figura 2H). Prenda a máscara facial com barbante enrolado em volta da máscara e prenda as duas extremidades do barbante ao limitador. Conecte a outra extremidade do tubo de capnografia ao monitor de sinais vitais.
    nota: É importante evitar que a corda fique sobre os olhos do coelho durante o experimento. Para fazer isso, prenda o barbante no meio da contenção entre as orelhas do coelho. Para melhorar o sinal de capnografia, crie uma válvula unidirecional usando fita adesiva e um pedaço fino de nitrilo que permitirá que o oxigênio entre na peça em T e direcione o CO2 exalado para o tubo de capnografia (Figura 2I).

2. Gravação de vídeo-EEG-ECG

1. Realizar gravação de vídeo-EEG-ECG usando um software de EEG disponível comercialmente.
   nota: Os eletrodos e o vídeo biopotenciais são bloqueados no tempo para posteriormente correlacionar os sinais elétricos e de vídeo (por exemplo, pico de EEG com um empurrão mioclônico).
2. Confirme a conectividade ideal, sem desvio de linha de base, sem ruído elétrico de 60 Hz e alta relação sinal-ruído. Especificamente, certifique-se de que cada fase da forma de onda cardíaca possa ser visualizada no ECG e que as ondas delta, e alfa não sejam visualmente obscurecidas por ruído de alta frequência no EEG.
   1. Se todos os eletrodos estiverem produzindo quantidades excessivas de ruído, ajuste o cabo de referência central. Se apenas um eletrodo for excessivamente barulhento, empurre-o mais profundamente na pele ou reposicione-o até que não haja nenhum metal exposto.
3. Ajuste o vídeo para que todos os coelhos possam ser vistos simultaneamente, o que permite a correlação da atividade motora com os achados do EEG (Figura 3A).
   nota: O sistema acomoda registros simultâneos de EEG/ECG/oximetria/capnografia de até 7 coelhos.
4. Inicie a gravação da linha de base de cada animal por um mínimo de 10-20 min ou até que a frequência cardíaca se estabilize para um estado calmo e relaxado (200-250 bpm) e os coelhos não exibam grandes movimentos por pelo menos 5 min. Adquira dados eletrográficos de largura de banda total sem filtros. Para melhor visualizar os dados, defina o filtro de baixa frequência (=filtro passa-altas) em 1 Hz e o filtro de alta frequência (=filtro passa-baixas) em 59 Hz.
   nota: Outro sinal de que o coelho está relaxado é o início dos fusos do sono EEG (discutidos mais adiante).
5. Adicione notas bloqueadas durante o experimento em tempo real para indicar o momento das intervenções (por exemplo, administração de medicamentos) e eventos neurocardíacos (por exemplo, pico de EEG, convulsões motoras, batimento ectópico e arritmias) e artefatos motores/investigadores.
   nota: Devido à frequência com que o investigador precisa aplicar uma intervenção (por exemplo, estimulação fótica, administração de drogas), para minimizar o estresse de um investigador entrar e sair da sala e abrir/fechar a porta, o investigador permanece no lado oposto da sala durante todo o experimento. O investigador senta-se o mais longe possível do animal e permanece imóvel e quieto para minimizar a perturbação potencial dos animais.

Resultados

Figura 1: Imagem dos eletrodos de EEG e ECG. (A) Eletrodos de ECG dobrados e eletrodos de EEG retos. (B) Como enganchar o eletrodo de ECG no tecido subcutâneo do coelho, de modo que fique completo. Abreviaturas (LL: Membro esquerdo, RA: Braço direito, RL: Membro direito, LA: Braço esquerdo, RF: Frontal direito, LF: Frontal esquerdo, Cz: Centro, RO: Occipital direito,...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
computador	vale	Optiplex 5040	Computador de aquisição
Eletrodo de ECG	RhythmLink	RLSND116-2,5	Eletrodos de pino subdérmico dobrados em 35 graus (0,4 mm de diâmetro) de 13 mm
Eletrodo de EEG	RhythmLink	RLSP513	Eletrodos de pino subdérmico retos de 13 mm de 5 torções (0,4 mm de diâmetro)
EEGLAB (2020)	Centro Swartz de Neurociência Computacional	Acesso aberto	Pode realizar análise espectral de EEG
Adaptador Ethernet para Ethernet	Linksys	USB3G16	Adaptador para conectar a câmera ao computador
Estofamento de espuma	genérico	N/A	Reduz a pressão aplicada no pescoço de coelhos pequenos pelo limitador para evitar os efeitos cardiorrespiratórios adversos da compressão do pescoço
MATLAB (R2019b, Atualização 5)	Obras de Matemática	N/A	Necessário para executar o EEGLAB
microfone	Estéreo Sony	ECM-D570P	Registro de manifestações audíveis de convulsões
Fita Médica Micropore, Papel, Branco	3m	1530-1	Usado para prender fios e criar tala de orelha
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	Software de aquisição e revisão
Estimulador Fótico	grama	PS22	Estimulador para controlar a frequência, atraso, duração, intensidade dos pulsos de luz
Organizador / empacotador de fios em material plástico	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Enrole os fios para reduzir o ruído
PS 22 Estimulador Fótico	Instrumentos de grama	BZA641035	Luz estroboscópica com frequência, atraso e intensidade de flash ajustáveis
Tubo de PVC	genérico	N/A	Evita que coelhos pequenos chutem as patas traseiras e causem lesões na coluna vertebral
Restritor de coelho	Plas-Labs	501-TC	Vários tamanhos de restrições para coelhos estão disponíveis. 6 "x 18" x 6 "neste estudo.
Almofada de borracha (booster)	genérico	N/A	Levanta coelhos pequenos na contenção para evitar a compressão do pescoço
Clipe de orelha SpO2	NONIN	61000	PureSAT/SpO2
Adaptador de sensor de SpO2	NONIN	Rolamento 13931	XPOD PureSAT/SpO2
Webcol Preparação de Álcool, Estéril, Grande, 2-ply	Covidien	5110	Para preparar a veia da orelha antes do cateterismo
LabChart Pro (2019, versão 8.1.16)	ADInstruments	N/A	Análise de ECG
Amplificador quântico	Natus	Rolamento 13926	Amplificador / digitalizador
Amplificador Quantum HeadBox	Natus	Rolamento 22134	Caixa de fuga de 64 pinos
Câmera PTZ SRG-X120 1080p com saída HDMI, IP e 3G-SDI	Sony	SRG-X120	Câmera Impela