Isolando células IPE e RPE: uma técnica para obter células epiteliais pigmentares oculares do olho de coelho

Resumo

Fonte: Bascuas, T., et al. Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário de Mamíferos para Terapia Gênica Não Viral. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, mostramos um procedimento para obter células epiteliais pigmentares oculares de um modelo de coelho. As células são úteis no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças degenerativas da retina.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

Coelhos brancos da Nova Zelândia foram eutanasiados por uma overdose de Pentobarbital (150 mg/kg) diluído em NaCl a 0,9% injetado intraperitoneal e os olhos foram enucleados imediatamente após o sacrifício.

1. Antes da preparação

1. Prepare o meio completo (DMEM/Ham's F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina e 2,5 μg/mL de anfotericina B). Aqueça o meio, 1x PBS e 0,25% de tripsina (se necessário) em banho-maria a 37 °C.
2. Coloque uma cortina estéril no exaustor para preparar um local de trabalho asséptico. Introduza todos os instrumentos e materiais estéreis necessários dentro do capô.
   nota: Apenas a enucleação dos olhos e a limpeza do tecido muscular e da pele remanescentes são os procedimentos realizados fora do capô, o restante das etapas deve ser realizado dentro do capô.

2. Isolamento de células PE de coelho

1. Use tesouras curvas e pinças Colibri para enuclear os olhos após a eutanásia do animal. Limpe o tecido muscular restante e a pele dos olhos usando tesoura e fórceps (não estéril).
   nota: O tamanho das tesouras e fórceps usados para a enucleação e limpeza dos olhos depende da espécie (por exemplo, para ratos e camundongos, os instrumentos serão menores do que os usados para suínos e bovinos) (ver Figura 1).
   1. Colete os olhos em um tubo de 50 mL cheio de PBS não estéril e transfira o tubo para a capela de fluxo laminar. Desinfete os olhos submergindo por 2 minutos em solução à base de iodo e, em seguida, transfira-os para uma placa de Petri cheia de PBS estéril.
2. Abertura da lâmpada
   1. Coloque um olho em uma compressa de gaze estéril e segure-a firmemente perto do nervo óptico. Abra o olho com o bisturi #11 e tesoura cerca de 2 mm abaixo do limbo. Remova o segmento anterior (córnea, cristalino e íris) e coloque-o em uma placa de Petri. Deixe o bulbo com o vítreo até que as células do EPR sejam isoladas.
3. Isolamento de células IPE
   1. Remova a lente e, com uma pinça fina, puxe delicadamente a íris que contém as células IPE. Coloque a íris em uma placa de Petri, lave com PBS estéril e deixe-a em PBS até que mais íris sejam preparadas. Remova o corpo ciliar da íris cortando com um bisturi # 10.
   2. Após a preparação de 2 íris, incubar com 1 ml de tripsina a 0,25% a 37 °C durante 10 min; durante este tempo, as células RPE podem ser isoladas (ver passo 2.4). Remova a tripsina e adicione 1 mL de meio completo à íris e isole as células raspando cuidadosamente com uma pipeta Pasteur polida a fogo. Ressuspenda as células cuidadosamente pipetando e transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL. Pegue 10 μL da suspensão celular e dilua 1:3 com azul de tripano para contar as células na câmara de Neubauer.
   3. Se não for transfectado imediatamente, semeie 200.000 células/poço em uma placa de 24 poços (100.000 células/^cm2) em 1 mL de meio completo (10% FBS) (para semeadura, consulte a Tabela 1). Coloque a placa em uma incubadora e cultive-a a 37 °C, 5% CO2.
      nota: Pode ser necessário agrupar vários olhos para ter células suficientes para a semeadura.
4. Isolamento de células RPE
   1. Remova o humor vítreo e a retina do segmento posterior com uma pinça fina. Evite danificar o epitélio pigmentar da retina.
   2. Coloque uma gaze estéril em uma placa de 12 poços e coloque o bulbo sobre a gaze.
   3. Lave com PBS. Adicione 50 μL de tripsina a 0,25% por olho e incube por 10 min a 37 ° C. Remova a tripsina e adicione 150 μL de meio completo por globo e raspe delicadamente as células RPE com uma pipeta Pasteur curvada polida a fogo; Use pinças finas para imobilizar o tecido. Recolha a suspensão celular e coloque-a em um tubo de 1,5 mL. Tome 10 μL da suspensão celular; diluir 1:4 com azul de tripano para contar as células na câmara de Neubauer.
   4. Centrifugue as células por 10 min a 120 x g.
   5. Se não for transfectado imediatamente, semeie 200.000 células/poço em uma placa de 24 poços (100.000 células/^cm2) em 1 mL de meio completo (10% FBS) (para semeadura, consulte a Tabela 1). Coloque a placa em uma incubadora e cultive-a a 37 °C, 5% CO2.
      nota: Pode ser necessário agrupar vários olhos para ter células suficientes para a semeadura.

Resultados

espécie	Tratamento com tripsina	N° Células IPE	N° Células RPE	Placa para semeadura (100.000 células/cm2)
coelho	Sim	~ 350.000	~ 2.500.000	Placas de 24 poços

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de 12 poços	Corning	353043
Placas de 24 poços	Corning	353047
Betadine	Mundipharma
Micro pinça Bonn plana
Pinça Colibri (estéril)
F12 do DMEM/Ham	Sigma-Aldrich	D8062
Cortina (estéril)	Mölnlycke Cuidados de Saúde	Rolamento 800530
FBS	Brunschwig	Pág. 40-37500
Fórceps (tamanho diferente) (estéril)
Compressa de gaze	PROMEDICAL AG	Rolamento 25403
NaCl (0,9%)	Laboratório Dr. Bichsel AG	1000090
Câmara de Neubauer	Marienfeld-superior	Nº 640010
Pipeta Pasteur (polidor de fogo)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicilina/estreptomicina	Sigma-Aldrich	Pág. P0781-100
Pentobarbital (tiopental inresa)	Ospedalia AG	31408025
Placa de Petri	ThermoFisher Scientific	150288
Scarpel nº 10	Swann-Morton	501
Scarpel nº 11	Swann-Morton	503
Tesoura Bonn Extra Fina curva de ponta afiada (estéril)
Ponta afiada reta Tesoura Bonn Extra Fina (estéril)
Tripsina 0,25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Tesoura de mola Vannas curva (estéril)