Isolamento de células IPE e RPE: uma técnica para obter células epiteliais pigmentadas de olho suíno isolado

Resumo

Fonte: Bascuas T. et al., Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário de Mamíferos para Terapia Gênica Não Viral. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, descrevemos uma técnica para isolar células epiteliais pigmentares da íris e da retina de olhos suínos para obter suas culturas primárias para estudos in vivo e ex vivo. Essas células pigmentares podem ser geneticamente modificadas para estudar abordagens regenerativas para tratar distúrbios oculares.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Antes da preparação

1. Prepare o meio completo (DMEM/Ham's F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina e 2,5 μg/mL de anfotericina B). Aqueça o meio, 1x PBS e 0,25% de tripsina (se necessário) em banho-maria a 37 °C.
2. Coloque uma cortina estéril no exaustor para preparar um local de trabalho asséptico. Introduza todos os instrumentos e materiais estéreis necessários dentro do capô.
   NOTA: Apenas a enucleação dos olhos e a limpeza do tecido muscular e da pele remanescentes são os procedimentos realizados fora do capô, o restante das etapas deve ser realizado dentro do capô.
3. Os olhos suínos foram obtidos de um matadouro local dentro de 6 horas após o sacrifício e foram transportados para o laboratório no gelo

2. Isolamento de células PE de suínos

1. Use tesouras curvas e pinças Colibri para enuclear os olhos após a eutanásia do animal. Limpe o tecido muscular restante e a pele dos olhos usando tesoura e fórceps (não estéril).
   nota: O tamanho das tesouras e fórceps usados para a enucleação e limpeza dos olhos depende da espécie (por exemplo, para ratos e camundongos, os instrumentos serão menores do que os usados para suínos e bovinos) (ver Figura 1).
   1. Colete os olhos em um tubo de 50 mL cheio de PBS não estéril e transfira o tubo para a capela de fluxo laminar. Desinfete os olhos submergindo por 2 minutos em solução à base de iodo e, em seguida, transfira-os para uma placa de Petri cheia de PBS estéril.
   2. Depois de transferir os olhos para uma placa de Petri estéril, segure um firmemente próximo ao nervo óptico com Colibri ou pinça pontiaguda. Faça um furo perto do limite da íris (entre pars plana e ora serrata) com uma agulha de 18 G. Insira uma tesoura pequena no orifício e corte ao redor da íris. Remova o segmento anterior (córnea, cristalino e íris) e coloque-o em uma placa de Petri. Deixe o bulbo com o vítreo até que as células do EPR sejam isoladas.

3. Isolamento das células IPE

1. Remova o corpo ciliar da íris cortando com um bisturi # 10. Após a preparação de 2 íris, adicione 1 mL de meio completo e isole as células coçando cuidadosamente com uma pipeta Pasteur polida a fogo. Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL. Pegue 10 μL da suspensão celular e dilua 1:4 com azul de tripano para contar as células na câmara de Neubauer.
2. Se não for transfectado imediatamente, semeie 200.000 células/poço em uma placa de 24 poços (100.000 células/^cm2) em 1 mL de meio completo (10% FBS) (para semeadura, consulte a Tabela 1). Coloque a placa em uma incubadora e cultive-a a 37 °C, 5% CO₂.
   nota: Pode ser necessário agrupar vários olhos para ter células suficientes para a semeadura.

4. Isolamento de células RPE

1. Execute a etapa 1.1.1. Coloque o bulbo em uma placa de Petri e lave com PBS. Encha o bulbo com 1 mL de meio completo.
2. Usando uma pipeta Pasteur polida a fogo curva, remova cuidadosamente as células RPE. Certifique-se de raspar de baixo para cima para evitar escorregar do complexo de membrana de Coroide-Bruch. Colete a suspensão celular dentro do bulbo usando uma pipeta de 1.000 μL e transfira para um tubo de 1,5 mL para ressuspensão. Pegue 10 μL da suspensão celular e dilua 1:8 com azul de tripano para contar as células na câmara de Neubauer.
3. Células de sementes conforme descrito na etapa 3.2.

Resultados

espécie	Tratamento com tripsina	N° Células IPE	N° Células RPE	Placa para semeadura (100.000 células/cm2)
porco	Não	~ 1.000.000	~ 3.000.000	Placas de 24 poços

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de 12 poços	Corning	353043
Placas de 24 poços	Corning	353047
Betadine	Mundipharma
Micro pinça Bonn plana
Pinça Colibri (estéril)
F12 do DMEM/Ham	Sigma-Aldrich	D8062
FBS	Brunschwig	Pág. 40-37500
Fórceps (tamanhos diferentes) (estéreis)
NaCl (0,9%)	Laboratório Dr. Bichsel AG	1000090
Agulha (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Câmara de Neubauer	Marienfeld-superior	Nº 640010
Pipeta Pasteur (polidor de fogo)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicilina/estreptomicina	Sigma-Aldrich	Pág. P0781-100
Placa de Petri	ThermoFisher Scientific	150288
Scarpel nº 10	Swann-Morton	501
Scarpel nº 11	Swann-Morton	503
Tesoura Bonn Extra Fina curva de ponta afiada (estéril)
Ponta afiada reta Tesoura Bonn Extra Fina (estéril)
Citômetro baseado em imagem Tali	ThermoFisher Scientific	T10796
Tripsina 0,25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Tripsina 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Tesoura de mola Vannas curva (estéril)