Modelo de Córnea Ex vivo de Ceratite Bacteriana em Suínos: Uma Técnica para Estabelecer Infecção Bacteriana em Células Epiteliais da Córnea

Resumo

Fonte: Okurowska, K., et al. Estabelecendo um modelo de córnea ex vivo suína para estudar tratamentos medicamentosos contra ceratite bacteriana. J. Vis. Exp (2020).

Este vídeo descreve um protocolo para configurar um modelo ex vivo para ceratite bacteriana usando um botão corneoescleral dissecado do olho suíno. As bactérias inoculadas atravessam as incisões epiteliais da córnea para invadir o estroma subjacente e estabelecer uma infecção nos tecidos da córnea que imita a infecção in vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE

1. Preparação de um inóculo

1. Despeje 10 mL de caldo LB em um frasco cônico de 50 mL com uma rolha de espuma.
2. Transferir uma colónia de P. aeruginosa estirpe PAO1 ou estirpe PA14 de uma placa de ágar fresco e incubar a 37 °C durante 3-4 h até que as bactérias estejam na fase intermediária
.
3. Transfira a cultura de bactérias para um tubo de 50 mL e centrifugue a 3.000 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em PBS.
4. Repita a etapa 1.3 mais duas vezes para lavar as células. Ressuspenda o pellet da célula em PBS e ajuste a densidade óptica em 600 nm para aproximadamente 0,6 usando PBS estéril como um branco.

2. Infectando o botão corneoescleral

1. Remova o meio da placa de Petri e enxágue as córneas duas vezes com 1 mL de PBS estéril.
2. Aperte suavemente a pinça enquanto segura a córnea no meio. Use um bisturi 10A para fazer quatro cortes - dois verticais, dois horizontais - na seção central do botão corneoescleral através da camada epitelial até o estroma subjacente.
3. Coloque um molde de vidro estéril em uma placa de 6 poços com a parte larga para cima e coloque a córnea no meio do molde de vidro, com o lado do epitélio voltado para baixo. Faça o corte bem no centro da parte inferior do molde de vidro.
4. ETAPA CRÍTICA: Despeje 1 mL de ágar de baixo ponto de fusão a 1% (p / v) dissolvido em DMEM para preencher completamente o molde de vidro com córnea.
5. Deixe o ágar-ágar endurecer e, em seguida, inverta o molde de vidro para que o epitélio da córnea fique voltado para cima.
6. Pipete 15 μL da cultura bacteriana com OD_600nm = 0,6 (para P. aeruginosa, isso equivale a aproximadamente 1 x 10⁷ unidades formadoras de colônias (UFC) em 15 μL) diretamente em uma área de corte e, em seguida, adicione 85 μL de PBS ao topo para manter o epitélio da córnea úmido. Dilua a cultura bacteriana restante e coloque em ágar para contar as unidades formadoras de colônias para o inóculo.
7. Adicione 1 mL de DMEM sem antibióticos no fundo de cada poço com o molde de vidro. Incube a placa de 6 poços com os botões corneoesclerais infectados em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO₂ por até 24 h.
8. Configure a córnea de controle não infectada ao lado de cada experimento. Para configurar o controle não infectado, substitua os 15 μL de cultura bacteriana na etapa 2.6 por PBS estéril.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo Falcon de 50 mL	Sls	Rolamento 352070
Anfotericina B	sigma	Rolamento A2942
Placa de 12 poços Cellstar	Greiner Bio-One	Nº 665180
dextrano	sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Científico	12899357
DMEM + glutamax	Sls	D0819
Incubadora de forno duplo	Sls	OVe1020	Forno de esterilização
Fator de crescimento epidérmico	Sls	E5036-200UG
PRESUNTO F12	sigma	N4888
Soro fetal de bezerro	Labtech Internacional	CA-115/500
fórceps	Fisher Científico	15307805
Heracell VIOS 160i	Thermo Científico	15373212	Incubadora para cultura de tecidos
Insulina humana recombinante	Sls	91077C-1G
ágar LB	sigma	L2897
Multitron	Infors	Não aplicável	Incubadora bacteriana
Pbs	Sls	Pág. 4417
Penicilina-estreptomicina	Sls	Pág. 0781
Placa de Petri	Fisher Científico	12664785
Placa de Petri 35x10mm CytoOne	Laboratório estelar	CC7672-3340
Iodopovidona	Farmácia Weldricks	2122828
Seguro 2020	Fisher Científico	1284804	Cabine de segurança para microbiologia classe II
Lâmina de bisturi número 15	Fisher Científico	O305
Bisturi Swann Morton	Fisher Científico	11849002