Modelo de biofilme de pulmão de porco ex vivo: uma técnica para desenvolver modelo de pulmão para estudar biofilmes bacterianos em tecido bronquiolar de porco

Resumo

Fonte: Harrington, N.E. et al., Teste de eficácia de antibióticos em um modelo ex vivo de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus no pulmão de fibrose cística. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo descreve o protocolo para o desenvolvimento de um modelo de biofilme bacteriano de biofilme bacteriano ex vivo em tecido bronquiolar infectado. Os biofilmes são agregados bacterianos embutidos em uma matriz aderente a uma superfície. Este modelo é usado para estudar a suscetibilidade a antibióticos de bactérias em diferentes estágios de formação de biofilme.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dissecção e infecção de tecido pulmonar de porco ex vivo (EVPL)

1. Faça SCFM para uso com tecido EVPL, siga a receita para SCFM modificado de 1 L fornecida na Tabela 1.
2. Antes da dissecção, prepare uma(s) placa(s) de ágar da(s) cepa(s) bacteriana(s) necessária(s) para infecção usando qualquer ágar padrão no laboratório para P. aeruginosa/S. aureus (por exemplo, caldo de lisogenia + ágar 1,2%).
3. Calcule quantos pedaços de tecido bronquiolar suíno são necessários para o experimento, incluindo pedaços de tecido de controle não infectados. Multiplique esse número por dois para repetir o experimento em dois pulmões replicados para confirmar a repetibilidade dos resultados.
4. Multiplique o número total de pedaços de tecido necessários por 0,5 para determinar o volume de agarose SCFM (mL) necessário para fazer almofadas de agarose para fazer meio suficiente para 400 μL / pedaço de tecido mais ágar SCFM sobressalente para contabilizar quaisquer erros de pipetagem ou evaporação durante a preparação.
5. Adicione 0,12 g de agarose a cada 15 mL de SCFM necessário para fazer o volume total desejado de SCFM com 0,8% de peso / volume de agarose.
6. Aqueça a solução de agarose SCFM até que a agarose esteja totalmente dissolvida. Recomenda-se um micro-ondas doméstico em baixa potência. O tempo necessário depende da potência do micro-ondas. Deixar a agarose arrefecer até cerca de 50 °C (quente ao toque, mas confortável de segurar). Não deixe esfriar mais.
7. Usando uma pipeta, adicione 400 μL de agarose SCFM a um poço de uma placa de 24 poços por pedaço de tecido necessário.
8. Esterilize a(s) placa(s) de 24 poços contendo agarose SCFM sob luz ultravioleta por 10 min.
9. Prepare três lavagens repetidas para cada pulmão intacto sendo dissecado usando 20 mL de meio Eagle modificado estéril de Dulbecco (DMEM) mais 20 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 estéril suplementado com 50 μg / mL de ampicilina.
10. Faça uma alíquota de 40 mL de SCFM como lavagem final para cada pulmão intacto que está sendo dissecado. Todas as lavagens podem ser armazenadas durante a noite a 4 °C ou usadas imediatamente.
11. Obtenha os pulmões da fonte designada o mais rápido possível após o abate, garantindo que sejam mantidos frios transportando-os para o laboratório em uma caixa térmica doméstica.
    nota: Os pulmões mais próximos do dia do abate apresentam menos hematomas devido ao armazenamento, mas o tecido mantido em armazenamento refrigerado por até 4 dias após o abate também pode ser usado. Como a caixa térmica precisa ser levada para o açougue ou matadouro, ela deve ser descontaminada seguindo as diretrizes do laboratório local após cada uso e armazenada fora do laboratório de microbiologia quando não estiver em uso, para reduzir o risco de contaminação e violação da contenção.
12. Trabalhando em uma superfície esterilizada e sob uma chama, coloque os pulmões em uma tábua de cortar de plástico limpa coberta com papel alumínio autoclavado. Verifique se os bronquíolos permanecem intactos. Se houver algum dano no matadouro ou durante o transporte, os pulmões não são adequados para uso.
13. Aqueça uma espátula sob uma chama e toque brevemente a faca na área do pulmão ao redor do bronquíolo para esterilizar a superfície do tecido.
14. Corte o tecido superficial ao redor do bronquíolo usando uma lâmina de barbear estéril. Faça incisões paralelas ao bronquíolo para evitar qualquer dano.
15. Uma vez que o bronquíolo tenha sido exposto, faça uma incisão transversal através do bronquíolo no ponto mais alto visível para liberar o bronquíolo.
16. Usando uma pinça estéril, segure levemente a extremidade livre do bronquíolo e corte qualquer tecido indesejado restante usando uma lâmina de barbear estéril. Faça uma incisão transversal final no bronquíolo antes que qualquer ramificação seja visível para remover o bronquíolo dos pulmões.
17. Coloque o bronquíolo na primeira lavagem DMEM/RPMI 1640. Deixe o bronquíolo na lavagem e repita as etapas 1.12 a 1.15 para colher seções adicionais de bronquíolo do mesmo pulmão, conforme necessário para produzir seções de tecido suficientes para o experimento planejado.
18. Coloque quaisquer seções bronquiolares adicionais do mesmo pulmão na lavagem (etapa 1.17). Deixe na lavagem por pelo menos 2 min.
19. Remova os bronquíolos da primeira lavagem DMEM / RPMI 1640 e coloque as amostras em uma placa de Petri estéril.
20. Segure cada bronquíolo levemente usando uma pinça estéril, certificando-se de não danificar o tecido. Remova o máximo possível de tecido mole restante e corte o tecido em tiras de ~ 5 mm de largura usando uma tesoura de dissecção estéril.
21. Coloque todas as tiras de tecido bronquiolar na segunda lavagem DMEM/RPMI 1640. Deixe na lavagem por pelo menos 2 min.
22. Remova as tiras de tecido da segunda lavagem usando uma pinça estéril, tomando cuidado para não danificar o tecido. Coloque o tecido em uma placa de Petri limpa e estéril.
23. Remova qualquer tecido mole restante preso ao bronquíolo e corte as tiras em quadrados (~ 5 mm x 5 mm) usando uma tesoura de dissecção estéril.
24. Adicione a terceira lavagem DMEM/RPMI 1640 na placa de Petri. Misture levemente os pedaços de tecido na lavagem, girando o prato.
25. Despeje a terceira lavagem da placa de Petri sem remover os pedaços de tecido.
26. Adicione a lavagem final do SCFM à placa de Petri contendo tecido, garantindo que todos os pedaços de tecido estejam cobertos.
27. Esterilize os pedaços de tecido em SCFM sob luz ultravioleta por 5 min.
28. Use uma pinça estéril para transferir cada pedaço de tecido bronquiolar esterilizado para poços individuais de uma placa de 24 poços contendo almofadas de agarose SCFM.
29. Para infectar cada pedaço de tecido com a cepa bacteriana desejada, toque em uma colônia cultivada em uma placa de ágar com a ponta de uma agulha de 29 G conectada a uma seringa estéril de insulina de 0,5 mL. Em seguida, toque a colônia no pedaço de tecido, picando suavemente a superfície do tecido.
    nota: O uso de uma seringa de insulina equipada com uma agulha de 29 G permite que a agulha seja segurada com precisão e conforto, mantendo os dedos a uma distância segura da agulha e do tecido pulmonar. É possível realizar esta etapa usando agulhas 29 G que não estão presas a uma seringa, mas isso requer maior destreza e aumenta o risco de ferimentos por picada de agulha. Seringas de insulina estão prontamente disponíveis.
30. Para os controles não infectados, pique suavemente a superfície de cada um dos pedaços de tecido com a ponta de uma agulha de 29 G presa a uma seringa estéril de insulina de 0,5 mL.
31. Use uma pipeta para adicionar 500 μL de SCFM a cada poço.
32. Esterilize uma membrana de vedação respirável para cada placa de 24 poços sob luz ultravioleta por 10 min (Tabela de Materiais).
33. Remova a(s) tampa(s) da(s) placa(s) de 24 poços e substitua-a pela membrana respirável.
34. Incubar as placas a 37 °C durante o tempo de incubação (infeção) desejado sem agitar. Verifique se não há crescimento visível do patógeno inoculado nas peças de controle não infectadas (controle de contaminação).
    nota: Se desejado, a ampicilina pode ser adicionada às almofadas de agarose SCFM e cobrindo o SCFM na etapa 1.31 até uma concentração final de 20 μg / mL. Isso suprimirá o crescimento da maioria das bactérias endógenas nos pulmões sem afetar o crescimento de P. aeruginosa ou S. aureus, mas, como a presença de ampicilina pode afetar a suscetibilidade a outros antibióticos, o leitor pode fazer essa escolha dependendo das cepas e antibióticos que deseja testar.

TABELA 1

1. Preparação de meio sintético de escarro para FC (SCFM) para uso com modelo de pulmão de porco ex vivo

Uma vez feito, o SCFM deve ser esterilizado por filtro e pode ser armazenado a 4°C por até um mês.

a) Receita principal
Etapa 1	químico	quantidade	Instruções	mM final em SCFM de 1L
	NaCl	3,03 gramas	Adicione sais e água à garrafa limpa, usada apenas para a preparação do SCFM	51,85
	Kcl	1.114 gramas		14.94
	dH2O	640 ml		N/A
Etapa 2	químico	Molaridade do estoque feito em água, esterilizado por filtro e armazenado a 4 ° C	Instruções	mM final em SCFM de 1L
	Na2HPO4	0,125 metros acima do nível do mar	Adicione 10 ml de cada caldo aos sais e à água preparados na etapa 1	1.25
	NaH2PO4	0,13 metros acima do nível do mar		1,30
	NH4Cl	0,228 metros acima do nível do mar		2.28
	KNO3	0,0348 metros acima do nível do mar		0,35
	K2SO4	0,0271 metros acima do nível do mar		0,27
	Mops	1 milhão		10.00
Etapa 3	químico		Instruções	mM final em SCFM de 1L
	19 soluções de aminoácidos preparadas de acordo com a secção b)		Adicionar 10 ml de cada caldo à solução preparada nos passos 1 e 2.	Ver secção b)
Etapa 4	Químico		Instruções	mM final em SCFM de 1L
	HCl ou NaOH conforme necessário		Use para ajustar o pH da solução preparada nas etapas 1-3 a 6.8. Volume recorde de ácido/base adicionado.	N/A
Etapa 5	Químico		Instruções	mM final em SCFM de 1L
	dH2O		Adicionar à solução preparada nos passos 1-4, até um volume final de 960 ml	N/A
Etapa 6	químico	Molaridade do estoque feito em água, esterilizado por filtro e armazenado a 4 ° C	Instruções	mM final em SCFM de 1L
	CaCl2	0,175 metros acima do nível do mar	Adicione 10 ml de cada estoque à solução preparada nas etapas 1-5	1,75
	MgCl2	0,0606 metros		0,61
Etapa 7	químico	Molaridade do estoque feito em água, esterilizado por filtro e armazenado a 4 ° C	Instruções	mM final em SCFM de 1L
	Ácido L-láctico	0,93 m	Faça estoque de água, pH a 7 com 5M NaOH. Adicione 10 ml à solução preparada nos passos 1-6.	9.30
Etapa 8	químico	Molaridade do material de trabalho feito em água, imediatamente antes de adicionar à receita	Instruções	mM final em SCFM de 1L
	Fe(III)SO4.7H2O	0.00036 m	Faça um estoque mestre de 0,036 M, que pode ser esterilizado por filtro e armazenado a 4°C enquanto a solução permanecer livre de precipitado. Para fazer o material de trabalho, adicione 110 μl do estoque mestre a 9.890 ml de dH2O e adicione o material de trabalho à solução preparada nas etapas 1-7.	0,0036

b) Preparação de estoques de aminoácidos; filtrar, esterilizar antes de usar e armazenar a 4°C.
aminoácido	Estoque mM	Instruções	mM final em 1 L SCFM
alanina	178	Dissolver em água	1.780
arginina	30.6	Dissolver em água	0,306
aspartato	82,7	Dissolver em NaOH 0,5 M	0,827
cisteína	16	Dissolver em água	0,160
ácido glutâmico	154,9	Dissolver em HCl 1 M	1.549
glicina	120,3	Dissolver em água	1.203
histidina	51.9	Dissolver em água	0,519
isoleucina	112.1	Dissolva em água aquecendo a 50 °C por 30 minutos em um shaker	1.121
leucina	160,9	Dissolver em água	1.609
lisina	212,8	Dissolver em água	2.128
metionina	63.3	Dissolver em água	0,633
Ornitina-HCl	67.6	Dissolver em água	0,676
fenilalanina	53	Dissolver em água	0,530
prolina	166	Dissolver em água	1.660
serina	144.6	Dissolver em água	1.446
treonina	107.2	Dissolver em água	1.072
triptofano	1.3	Dissolver em NaOH 0,2 M	0,013
tirosina	80.2	Dissolver em NaOH 1M	0,802
valina	111,7	Dissolver em água	1.117

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringas de insulina - 0,5 mL com agulha 29G acoplada.	VWR	BDAM324892
Placas de cultura de 24 poços
Etanol 70% ou similar para esterilização de superfície e queima de equipamentos de dissecação
Placas de ágar para preparar estrias de P. aeruginosa / S. aureus (qualquer meio adequado)
agarose
Folha de alumínio - pré-esterilizada por autoclave - para cobrir a tábua de cortar na qual você dissecará os pulmões.
Membrana de vedação Breathe-easy ou Breathe-easier para placas multipoços	Biotecnologia diversificada	BEM-1 ou BERM-2000
bico de Bunsen
Tábua de cortar - recomendamos uma tábua de plástico para permitir uma fácil descontaminação com álcool.
Caixa térmica para transportar pulmões para o laboratório
Tesouras de dissecção em diferentes tamanhos
Meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)
Faca de palete grande
Lâminas de barbear montadas
Placas de Petri
Tábua de cortar de plástico e folha de alumínio para criar uma superfície de dissecação estéril e lavável
Instituto Memorial de Roswell Park (RPMI) 1640 médio
SCFM			Ingredientes listados na Tabela 1
Seleção de pinças (pontas rombas recomendadas)
Recipientes adequados para descarte de perfurocortantes e tecido pulmonar de suínos contaminados, de acordo com o da sua instituição políticas de saúde e segurança.