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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Dissecção de tecido
- Prepare o tecido suíno usando um espaço de trabalho de dissecção não estéril.
- Adquira olhos suínos enucleados de um matadouro local, estudos com animais ou fornecedor. Mantenha os olhos no gelo submerso em PBS durante a entrega e use imediatamente após o recebimento.
- Corte o tecido extraorbital e apare a conjuntiva, deixando apenas a concha corneoescleral e o nervo óptico. Realize a dissecção em condições não estéreis com tesouras cirúrgicas grandes e pinças em um pacote de ferramentas de dissecção macroscópica.
- Coloque os olhos de volta no PBS fresco no gelo até que todos os olhos necessários para a configuração experimental tenham sido preliminares / dissecados macroscopicamente.
- Mergulhe os olhos em solução de betadina a 10% por 2 min em recipientes fechados e transfira assepticamente para o gabinete BSC II para microdissecção (gabinete #1). Execute todos os trabalhos subsequentes em condições estéreis para minimizar as contaminações durante a configuração.
- Dissecar estéreis os segmentos anteriores.
- Após 2 min em solução de betadina, transfira os olhos para três lavagens seriadas de antibiótico-antimicótico-PBS ESTÉRIL (AA-PBS) para remover o excesso de solução de betadina da superfície ocular, mantendo a esterilidade do tecido ocular. Após três lavagens, manter o tecido em AA-PBS até nova utilização.
- Hemisseccione o olho usando uma lâmina de barbear / bisturi e uma tesoura curva. Coloque o olho em uma gaze embebida em AA-PBS e faça uma incisão com uma lâmina de barbear estéril ou bisturi perto do equador do olho (60/40 dividido com 40 no lado anterior). Usando uma tesoura cirúrgica curva, hemisseccione o olho para isolar o olho anterior (metade da córnea).
nota: O corte ao redor do segmento anterior precisa ser contínuo para evitar bordas irregulares e ásperas na esclera que criarão vazamentos de fluido após a configuração na cultura de órgãos.
- Use uma microtesoura como uma pá para retirar o humor vítreo do segmento anterior. Remova a lente do segmento anterior usando uma microtesoura. Deixe os segmentos anteriores em AA-PBS até novas etapas de dissecção.
nota: Todos os olhos que serão dissecados podem ser mantidos nesta etapa e, um a um, tomados pelo restante do processo de dissecação.
- Com um microscópio de dissecação, corte a íris à raiz da íris gradualmente, radialmente até que a malha trabecular (TM) seja visível. A MT é um tecido pigmentado que compreende fibras circunferencialmente orientadas ao redor da concha corneoescleral. Cortes cuidadosos na íris em direção à raiz da íris exporão a profundidade da MT sob o tecido.
- Corte 360° ao redor da íris na mesma profundidade do corte inicial no tecido para expor toda a região da MT. Limpe qualquer íris residual restante cobrindo a MT conforme necessário.
- Apare os restos do corpo ciliar posteriores à MT, deixando apenas uma fina faixa de tecido posterior à região da MT (aproximadamente 1 mm).
- Coloque o segmento anterior dissecado (AS) em meio até que a configuração seja posterior em cultura de órgãos do segmento anterior (ASOC) no gabinete BSC II de montagem da placa (gabinete #2).
nota: Todos os olhos podem ser mantidos neste ponto antes da configuração do ASOC se um único usuário estiver realizando a dissecção e a montagem da placa de cultura de órgãos.