Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Configurando segmentos anteriores em placas de cultura de órgãos
- Coloque um único segmento anterior (AS) em uma placa de Petri com AS invertido (copo para cima). Usando um cotonete, molhe a mídia e passe suavemente no centro da córnea para remover qualquer pigmento. Usando uma pinça para segurar o olho e o mesmo cotonete, limpe o cotonete ao redor da esclera para remover o pigmento extra.
- Inverta o AS e coloque em cima da parte inferior do prato sobre a região elevada, centralizando a córnea sobre a região elevada do prato. Coloque o clampanel em cima do AS recém-colocado.
- Coloque quatro parafusos nos orifícios correspondentes para manter o anel no lugar com o AS sob o anel. Aperte suavemente os parafusos com a chave L.
nota: A etapa de aperto acontecerá diariamente durante todo o experimento, portanto, o objetivo do aperto inicial aqui é garantir que a mídia não vaze, evitando quebrar o anel de fixação.
- Com um conjunto de placas de Petri estéreis, coloque a parte superior sobre a placa e inverta a configuração. Fixe o suporte para pratos. Conecte os conectores fluídicos com anéis de vedação às portas rosqueadas na parte inferior do prato.
- Em um conector fluídico, conecte um cubo de agulha dobrado de 18 G 90 °, um pedaço de tubo, um cubo de agulha de 18 G, um filtro de seringa de nylon, uma válvula de três vias e uma seringa de 20 mL cheia de meio.
- Ao segundo conector fluídico, conecte um cubo de agulha dobrado de 18 G a 90 ° graus, comprimento do tubo, um cubo de agulha de 18 G, uma válvula de três vias e a parte cilíndrica de uma seringa estéril de 10 mL (isso atuará como um reservatório para capturar líquido e bolhas do ASOC).
- Com as válvulas de três vias abertas adequadamente para as seringas, empurre suavemente o meio através do sistema usando a porta do conector de fluidos identificada na etapa 1.5 para inflar o AS, encher o meio na tubulação e, eventualmente, o reservatório.
nota: Se o meio vazar para o prato ASOC, o AS não está preso com força suficiente com o anel de fixação.
- Remova as bolhas empurrando suavemente a mídia para dentro do prato e invertendo o prato para empurrar as bolhas para dentro do reservatório.
- Coloque o prato e fique em pé. Coloque a parte inferior de uma placa de Petri embaixo dos pés do suporte, com cuidado para não enroscar no tubo.
2. Iniciando a cultura de órgãos do segmento anterior
- O ASOC agora está pronto para incubação. Coloque a placa ASOC na incubadora de cultura de células (37 °C, 5% CO2). Certifique-se de que a altura do prato ASOC na incubadora acima dos transdutores de pressão seja conhecida e contabilizada para calcular a pressão intraocular (PIO) com precisão.
- Direcione as tubulações para fora pela parte inferior da porta da incubadora a 37 °C, 5% de CO2 para que não interfiram na abertura e fechamento da porta. Conecte a seringa de 20 mL à bomba de seringa ajustada para 2.5 μL / min.
- Posicione a tubulação com o reservatório no instrumento do transdutor de pressão. Conecte a válvula lateral de 3 vias à configuração do transdutor de pressão enquanto flui PBS através da linha para evitar que bolhas de ar entrem nas linhas de tubulação.
nota: Esvazie o PBS dos reservatórios após a configuração do sistema para reduzir a probabilidade de contaminação do reservatório com crescimento microbiano durante a cultura de órgãos.
- Inicie a coleta de dados IOP garantindo primeiro a presença de um cartão microSD para salvar arquivos de dados. Em seguida, ligue a configuração do transdutor de pressão para iniciar a coleta de dados.
3. Manutenção diária do ASOC
- Após 24 h de equilíbrio do ASOC, retirar as placas da incubadora de CO2 a 37 °C, 5% e colocá-las no gabinete de Biossegurança (BSC) II.
nota: Na aquisição de dados de pressão, esses períodos de tempo parecem picos à medida que os ASOCs são removidos da incubadora (mudança de altura) e ajustados no gabinete.
- Verifique se há vazamentos sob cada prato na placa de Petri. Se houver, verifique se há conexões fluídicas apertadas sob o prato e reaperte se necessário. Verifique se há vazamentos no tampo do prato usando uma chave L estéril para apertar os parafusos no anel de fixação.
nota: O tecido da esclera AS comprimirá e reduzirá a espessura em 24 h, e o anel de fixação precisará ser apertado.
- Aspire bem o meio do prato.
nota: A malha trabecular está filtrando o fluido do meio que está sendo bombeado para o ASOC. Portanto, a mídia estará presente no prato ASOC ao longo das bordas.
- Repita as etapas 1.7 e 1.8 para remover quaisquer bolhas de ar presas.
- Reabasteça as seringas nas bombas de seringa, certifique-se de que as bombas de seringa estejam funcionando e confirme o alinhamento das válvulas de perfusão no ASOC. Retorne a placa ASOC para a incubadora de CO2 a 37 °C, 5%.
nota: Idealmente, essas etapas devem ser executadas diariamente. No entanto, o uso de um volume inicial de 20 mL de meio, o volume do poço do prato ASOC e uma taxa de bombeamento de 2.5 μL/min deve ser suficiente para permitir que o sistema funcione por vários dias sem perturbações.
