Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Fatiamento de tecido cardíaco de porco
- Configure o banho de tecido no vibratome, adicione gelo à camisa de resfriamento do banho de tecido e, em seguida, adicione a solução de Tyrode ao banho de tecido. Configure um frasco de plástico de 1 L para coletar o descarte de gelo derretido da camisa de resfriamento do banho de tecido. Para 1 L da solução de Tyrode, misture 3 g/L de monóxido de 2,3-butanodiona (BDM), 140 mM de NaCl (8,18 g), 6 mM de KCl (0,447 g), 10 mM de D-glicose (1,86 g), 10 mM de HEPES (2,38 g), 1 mM de MgCl2 (1 mL de solução 1 M), 1,8 mM de CaCl2 (1,8 mL de solução 1 M), até 1 L de ddH2O. Ajuste o pH para 7,40 usando NaOH. Em seguida, filtre a solução usando um sistema de filtro/armazenamento a vácuo de 1.000 mL 0,22 μm e armazene a 4 °C durante a noite.
- Sob o gabinete de biossegurança, transfira o coração de porco para uma bandeja contendo 1 L de solução cardioplégica fria fresca. Para 1 L da solução cardioplégica, misture 110 mM de NaCl (6,43 g), 1,2 mM de CaCl2 (1,2 mL de solução 1 M), 16 mM de KCl (1,19 g), 16 mM de MgCl2 (3,25 g), 10 mM de NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL de heparina, até 1 L de ddH2O. Ajuste o pH para 7,40 usando NaOH. Em seguida, filtre a solução usando um sistema de filtro/armazenamento a vácuo de 1.000 mL 0,22 μm e armazene a 4 °C durante a noite.
nota: Adicione 1.000 U / L de heparina na solução de cardioplegia no dia do corte.
- Disseque o coração para isolar o ventrículo esquerdo usando bisturis estéreis retráteis. Em seguida, corte o ventrículo esquerdo em blocos de 1−2 cm3 cada usando lâminas retangulares de lâmina. Use uma peça para fatiar e mantenha as peças restantes em um tubo de 50 mL em solução fria de Tyrode em gelo para cortar posteriormente, se necessário.
nota: Massageie o tecido antes de cortar com as mãos, especialmente se este for o segundo bloco. A massagem ajuda a restaurar a configuração correta das fibras musculares e evita qualquer rigidez dentro do bloqueio cardíaco.
- Adicione 1−2 gotas de cola de tecido (Tabela de Materiais) ao suporte de amostra de metal e cole um pedaço do bloco de ágar 4% com uma área de superfície de aproximadamente 1 cm2.
- Adicione 1−2 gotas de cola de tecido no ágar.
- Cole o bloco cardíaco no ágar com o lado do epicárdio cardíaco voltado para baixo na cola de tecido e certifique-se de que esteja o mais plano possível. Em seguida, transfira o porta-lenços com o bloco cardíaco para sua posição no banho de corte do vibratome.
- Conecte o tubo de oxigênio ao banho de fatiamento e a bandeja de metal cheia com a solução de Tyrode para coletar as fatias (banho de Tyrode oxigenado). Em seguida, adicione filtros de células de 40 μm na bandeja de metal para coletar as fatias após o corte.
- Ajustando a posição de fatiamento
- Usando o software de operação do vibratome e o painel, ajuste a altura da lâmina/sample. Selecione o botão de altura e siga as instruções na tela para ajustar a altura. O ideal é ter a lâmina perto do topo do tecido, mas abaixo dos músculos papilares e certifique-se de que haja líquido cobrindo o tecido e a lâmina antes de cortar.
- Ajuste onde começar a cortar o tecido selecionando o botão avançar. Pressione o botão de fatia e aumente a velocidade usando o botão para mover a lâmina em direção à borda do tecido. Em seguida, pressione fatiar novamente para parar e pressione o botão de avanço para desativar o processo.
- Ajuste os parâmetros de corte: velocidade de avanço = 0,03 mm/s, frequência de vibração = 80 Hz e amplitude de vibração horizontal = 2 mm. Em seguida, comece a fatiar selecionando o botão fatiar.
- Deixe o vibratomo fatiar até atingir o final do tecido, mas antes de atingir a extremidade traseira do suporte da amostra. Neste ponto, pressione fatiar novamente para parar. Aperte o botão Return para voltar à posição inicial.
- Selecione a repetição automática (clicando duas vezes), o que permitirá que o micrótomo vibratório repita automaticamente o processo de corte por até 99 vezes.
- Coletando fatias
- Espere até que as fatias estejam cheias e pareçam boas (depois de passar pelas camadas musculares papilares) e comece a coletar as fatias.
- Colete as fatias usando uma pipeta de plástico Pasteur cheia de solução fria de Tyrode para pegar suavemente o lenço do banho. Se necessário, use uma pinça e uma tesoura de mola para dissociar a fatia do bloqueio cardíaco se o tecido ainda estiver preso.
- Transfira a fatia para um filtro de células no banho de Tyrode oxigenado (consulte a etapa 1.7) e use o líquido na pipeta de plástico Pasteur para que o tecido fique plano em um dos filtros de células e, em seguida, adicione uma arruela de metal na parte superior para segurar o tecido.