Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento de complexos cumulus-oócitos suínos
- Para coletar material para o isolamento de folículos ovarianos, excisar ovários suínos de marrãs pré-púberes (aproximadamente 6-7 meses de idade, pesando 70 a 80 kg) em um matadouro local. Escolha aproximadamente 20 ovários de porcos de 10 animais para isolamento de complexos cumulus-oócitos (COCs) em cada experimento.
nota: Supondo que cada ovário produza de 3 a 5 folículos, o número total de folículos varia de 60 a 100.
- Coloque os ovários em uma garrafa térmica com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4; 38 ° C) contendo solução antimicótica (AAS) a 1%. Certifique-se de que o material experimental seja transportado para o laboratório dentro de 1 h, onde é enxaguado duas vezes com PBS estéril contendo antibióticos.
- Após enxaguar os ovários, transferi-los para o copo cheio de meio de manipulação (HM) (Tabela de Materiais) e armazená-los em uma incubadora a 38 °C durante o tempo de todas as manipulações.
nota: Para obter ótimos resultados durante o manuseio de oócitos, realizar todos os procedimentos em meio DMEM/F12 (meio de manuseio, HM) com adição de 2,5% de antibiótico/AAS e 10% de soro fetal bovino (SFB) e controlar o pH no nível de CO2 no ambiente, em mesa de aquecimento com controle de temperatura (38 °C) e sob a capela de fluxo laminar para minimizar a contaminação bacteriana.
- De grandes folículos suínos (6-8 mm de diâmetro) colete fluido folicular (FF) por aspiração e centrifugação a 100 x g por 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, filtre o sobrenadante usando uma seringa estéril conectada a filtros de poros de membrana de 0,2 μm e congele a -80 ° C.
nota: Use uma seringa de insulina (u-40) para aspiração do fluido folicular.
- Certifique-se de que apenas folículos saudáveis e de tamanho médio (4-6 mm de diâmetro) sejam selecionados para isolamento dos AOCs.
nota: Os CCOs de grau I, possuindo um oócito intacto e redondo com ooplasma homogêneo e cumulus compacto multicamadas (pelo menos 3-4) são considerados adequados para procedimentos posteriores de MIV 3D.
- Para isolar os COCs, transfira 2-3 ovários para uma placa de Petri estéril de 10 cm de diâmetro cheia de HM. Isole os COCs de folículos de tamanho médio seguindo um dos procedimentos abaixo.
- Corte suavemente a superfície dos folículos ovarianos salientes com uma lâmina cirúrgica estéril 15C. Isso fará com que o fluido folicular junto com os COCs fluam para a placa de Petri.
- Aspirar o conteúdo folicular com agulha 28 G de tamanho 5/8" acoplada a uma seringa descartável e transferir para a placa de Petri.
nota: Descarte os restos de tecido ovariano. Os estágios subsequentes de isolamento são realizados sob um estereomicroscópio.
- Prepare 3–5 placas de Petri de fertilização in vitro de 60 mm.
- Adicione 1 mL de HM aos poços centrais e coloque 3-4 gotas de HM (50 μL por gota) em seus anéis externos.
- Em seguida, usando uma micropipeta de policarbonato, mova os COCs não danificados para gotas de HM nos anéis externos para enxaguá-los brevemente por 3-4 vezes.
- No final, transfira-os individualmente para o poço central. Armazene essas placas de fertilização in vitro em uma incubadora para procedimentos adicionais.