Sistema de Microbiorreator de Mármore Líquido: Um Protocolo de Cultura 3D para Encapsulamento de Oócitos Suínos

Resumo

Fonte: Gorczyca, G., et al. Hidrogéis de alginato degradados proteoliticamente e microbiorreatores hidrofóbicos para encapsulamento de oócitos suínos. J. Vis. Exp. (2020).

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para o encapsulamento de oócitos suínos em microbiorreatores hidrofóbicos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Encapsulamento em microbiorreatores super-hidrofóbicos de etileno propileno fluorado (FEP).

NOTA: Certifique-se de que todos os procedimentos de maturação in vitro (IVM) sejam realizados em uma mesa controlada termostaticamente e que os complexos cumulus-oócitos (COCs) sejam mantidos a 38 °C durante todo o manuseio.

1. Preparar uma placa de Petri de 30 mm contendo 5 g de FEP em leito de pó com granulometria média de 1 μm
   NOTA: É importante usar pó FEP fresco. O FEP reutilizado tende a agregar-se e formar aglomerados.
2. Distribua uma única gota de meio de maturação (MM) (~ 30 μL em volume) contendo 3-5 COCs no leito do pó FEP. Gire a placa suavemente em movimentos circulares para garantir que essas partículas cubram completamente a superfície da gota líquida e as bolinhas líquidas formadas (LM).
3. Pegue o LM formado usando uma pipeta com uma ponta de 1.000 μL.
   NOTA: Corte a ponta da pipeta na borda para acomodá-la ao diâmetro do LM (4-5 mm). O diâmetro aproximado de tal ponta preparada deve ser ligeiramente maior que o do LM.
4. Prepare várias placas de Petri de fertilização in vitro (FIV) de 60 mm. Adicione 3-4 mL de água estéril aos anéis externos para preparar a câmara de umidade. Em seguida, coloque um LM no poço central.
   NOTA: Este procedimento requer boas habilidades manuais e precisão - se a bola de gude for colocada descuidadamente ou cair mesmo de uma altura baixa, ela será destruída.
5. Incubar bolinhas de gude durante 4 dias a 38 °C numa incubadora de CO₂ a 5%.
   1. Troque o meio diariamente seguindo o procedimento: aplique 30 μL de MM em cada LM, o que causará sua espalhamento porque o contato direto com o líquido interrompe a hidrofobicidade dos pós FEP revestidos. Quando o teor de mármore se dissolver, transfira os COCs liberados do biorreator para uma gota de MM fresco na placa de Petri.
      NOTA: Para transferir com precisão os COCs liberados, use uma micropipeta de policarbonato.
   2. Após várias lavagens em MM (3-4 vezes) para remover as partículas de FEP, transfira-as com 30 μL de MM fresco para o leito de pó de FEP. Gire suavemente a placa em movimentos circulares para garantir que as partículas de pó cubram completamente a superfície da gota de líquido e formem um novo LM.
   3. Pegue o LM formado usando uma pipeta com uma ponta de 1.000 μL.
   4. Adicione 3-4 mL de água estéril aos anéis externos para preparar a câmara de umidade. Em seguida, coloque um LM no poço central da placa de Petri de fertilização in vitro.
      NOTA: O revestimento transparente do pó FEP permite monitorar o conteúdo do LM usando um microscópio óptico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de maturação
hCG (1 FRASCO PARA INJETÁVEIS de 10 000 U)	Sigma-Aldrich	CG10
PMSG	BioVendor	RP1782721000
DMEM/F12 (500ml)	Sigma-Aldrich	D8062	Meio de maturação
FCS (100 ml)	Thermo Fisher	16140063	10% de concentração final para o meio de maturação
Mármore líquido
FEP	Dyneon GmbH 3M AdMD	A-66670
Instrumentos e ferramentas específicos
Placa de Petri de 30 mm	TPP	Rolamento 93040
Placa de Petri de FIV de 60 mm	falcão	353653
Pipetador de Manuseio de Células Premium Ez-Grid	Ciências da Vida do RI	8-72-288
Ponta Ez-Tip	Ciências da Vida do RI	8-72-4155/20
incubadora	Panasonic	MCO-170AIC-PE	Outras marcas podem ser usadas
Placa de Petri estéril (10 cm)	NEST Biotecnologia	704002