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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Encapsulamento em microbiorreatores super-hidrofóbicos de etileno propileno fluorado (FEP).
NOTA: Certifique-se de que todos os procedimentos de maturação in vitro (IVM) sejam realizados em uma mesa controlada termostaticamente e que os complexos cumulus-oócitos (COCs) sejam mantidos a 38 °C durante todo o manuseio.
- Preparar uma placa de Petri de 30 mm contendo 5 g de FEP em leito de pó com granulometria média de 1 μm
NOTA: É importante usar pó FEP fresco. O FEP reutilizado tende a agregar-se e formar aglomerados.
- Distribua uma única gota de meio de maturação (MM) (~ 30 μL em volume) contendo 3-5 COCs no leito do pó FEP. Gire a placa suavemente em movimentos circulares para garantir que essas partículas cubram completamente a superfície da gota líquida e as bolinhas líquidas formadas (LM).
- Pegue o LM formado usando uma pipeta com uma ponta de 1.000 μL.
NOTA: Corte a ponta da pipeta na borda para acomodá-la ao diâmetro do LM (4-5 mm). O diâmetro aproximado de tal ponta preparada deve ser ligeiramente maior que o do LM.
- Prepare várias placas de Petri de fertilização in vitro (FIV) de 60 mm. Adicione 3-4 mL de água estéril aos anéis externos para preparar a câmara de umidade. Em seguida, coloque um LM no poço central.
NOTA: Este procedimento requer boas habilidades manuais e precisão - se a bola de gude for colocada descuidadamente ou cair mesmo de uma altura baixa, ela será destruída.
- Incubar bolinhas de gude durante 4 dias a 38 °C numa incubadora de CO2 a 5%.
- Troque o meio diariamente seguindo o procedimento: aplique 30 μL de MM em cada LM, o que causará sua espalhamento porque o contato direto com o líquido interrompe a hidrofobicidade dos pós FEP revestidos. Quando o teor de mármore se dissolver, transfira os COCs liberados do biorreator para uma gota de MM fresco na placa de Petri.
NOTA: Para transferir com precisão os COCs liberados, use uma micropipeta de policarbonato.
- Após várias lavagens em MM (3-4 vezes) para remover as partículas de FEP, transfira-as com 30 μL de MM fresco para o leito de pó de FEP. Gire suavemente a placa em movimentos circulares para garantir que as partículas de pó cubram completamente a superfície da gota de líquido e formem um novo LM.
- Pegue o LM formado usando uma pipeta com uma ponta de 1.000 μL.
- Adicione 3-4 mL de água estéril aos anéis externos para preparar a câmara de umidade. Em seguida, coloque um LM no poço central da placa de Petri de fertilização in vitro.
NOTA: O revestimento transparente do pó FEP permite monitorar o conteúdo do LM usando um microscópio óptico.