Preparação de Qualidade pirofosfatos Inositol

Summary

Pirofosfatos inositol desempenhar um papel importante em patologias humanas como câncer, diabetes e obesidade, no entanto, o mecanismo exato de ação é uma questão de disputa. A falta de disponível comercialmente pirofosfatos inositol estudos detalhados torna problemática. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para produzir e isolar miligramas de pirofosfatos inositol.

Abstract

Myo-inositol está presente na natureza ou não modificado ou mais complexos derivados fosforilados. Do último, os dois mais abundantes nas células eucarióticas são pentakisphosphate inositol (IP ₅₎ e hexakisphosphate inositol (ácido fítico ou IP _6). IP ₅ e IP ₆ são os precursores de moléculas de pirofosfato inositol que contêm uma ou mais ligações pirofosfato ^1. Fosforilação de IP ₆ gera diphoshoinositolpentakisphosphate (IP ₇ ou PP-PI ₅₎ e bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP ₈ ou (PP) _{2 IP-4).} Pirofosfatos inositol foram isolados de todos os organismos eucarióticos, até agora estudados. Além disso, as duas classes distintas de enzimas responsáveis ​​pela síntese de pirofosfato inositol são altamente conservadas ao longo da evolução ^2-4.

O IP ₆ quinases (IP ₆ Ks) possuem uma enorme flexibilidade catalítico, convertendo IP ₅ e IP ₆ a PP-IP ₄ e IP _7, respectivamente e, posteriormente, usando estes produtos como substratos, promover a geração de moléculas mais complexas ^5,6 . Recentemente, uma segunda classe de enzimas gerando pirofosfato foi identificada na forma da proteína de levedura VIP ₁ (também conhecido como PP-PI ₅ K), que é capaz de converter IP _{6 e} IP ₇ e ₈ IP ^7,8.

Pirofosfatos inositol regular muitas diferentes processos celulares, tais como a secreção de insulina, ^{9 de} telômeros de comprimento ^10,11, quimiotaxia, ^{12 de} tráfico vesicular ^{13, 14} e homeostase do fosfato HIV-1 gag release ^15. Dois mecanismos de ação têm sido propostos para esta classe de moléculas. Eles podem afetar a função celular por alostericamente interagir com proteínas específicas como a AKT ^16. Alternativamente, o grupo pirofosfato pode doar um fosfato de pré-fosforilada proteínas ^17. O enorme potencial deste campo de pesquisa é dificultada pela ausência de uma fonte comercial de pirofosfatos inositol, que está impedindo que muitos cientistas de estudar essas moléculas e esta modificação pós-translacional novo. Os métodos actualmente disponíveis para isolar pirofosfatos inositol exigem aparato cromatográfico sofisticado ^18,19. Estes procedimentos utilizam condições ácidas que podem levar à degradação pirofosfato inositol ²⁰ e, assim, para a recuperação pobres. Além disso, o incômodo procedimentos pós-coluna dessalinização restringir seu uso aos laboratórios especializados.

Neste estudo, descrevemos um método pouco exigente para a geração de isolamento e purificação dos produtos do IP _6-quinase e PP-IP _5-quinases reações. Este método foi possível pela capacidade de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver altamente fosforilada polifosfatos inositol ^20. Após IP ₆ K1 e PP-IP ₅ reações enzimáticas K usando ₆ IP como substrato, PAGE foi usada para separar o pirofosfatos gerada inositol, que foram posteriormente eluídos em água.

Protocol

1. Reação enzimática – 1 º dia (1 hora da tarde)

1. O primeiro passo é preparar 20/10 independentes reações enzimáticas em que IP ₆ K1 ou VIP1 converter IP _{6 e} as isoformas pyrophosphorylated.
2. Usamos His-IP ₆ K1 e GST-Vip1 enzimas purificada de E. coli acordo com o protocolo descrito anteriormente ^17,18.
3. Prepare 50 mL reações contendo 1X tampão de reação (30 mM Hepes pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO _4, 1 mM DTT), 6 mM fosfocreatina (PCr), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg sal), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 mg His-IP ₆ K1 ou GST-Vip1. Ajustar o volume com MiliQ DDH ₂ O.
4. Brevemente girar a reação e incubar a 37 ° C durante a noite com rotação.

2. Fundição em gel de poliacrilamida e carregamento – dia 2 (4 horas da tarde)

1. O gel de poliacrilamida é preparada usando 24 cm de comprimento, 18 cm de largura e placas de vidro 1,5 milímetros espaçadores de largura. Geralmente uma faixa de 16 ou um preparativo comb única pista é usada.
2. Prepare uma mistura (50 mL / gel) contendo o seguinte: 35,5% (w / v) acrilamida: bis-acrilamida 19:1, persulfato de amônio 1X Tris / Borato / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) (APS ), 0,05% (w / v) Temed. Despeje a mistura entre o pré-fundido placas de vidro, coloque o pente e deixar polimerizar por 30-60 minutos em temperatura ambiente.
3. Uma vez que o gel tem polimerizado, a transferência do aparelho para a sala fria e pré-executado em TBE 1X por cerca de 30-60 minutos a 200-300 Volts.
4. Adicionar 1X de OrangeG corante (10 mM Tris-HCl pH 7,0, EDTA 1 mM, glicerol 30%, 0,1 OrangeG%) para cada reação. Preparar uma amostra contendo 2 nmol de IP ₆ para carregar como um controle padrão.
5. Lavar cada cavidade completamente com tampão de corrida usando uma seringa e uma agulha 21G para remover qualquer precipitado, em seguida, carregar o gel. Evitar carregar nos poços de lado.
6. Executar o gel durante a noite a 450-550 volts (7 mAmp / gel), até que a banda corante OrangeG é nos últimos 10 cm da parte inferior do gel.

3. Isolamento do IP ₇ – dia 3 (4 horas) e dia 4 (6-7 processo SpeedVac hora de secagem)

1. Desmontar o aparelho gel e remova cuidadosamente uma placa de vidro deixando o gel sobre o outro. Corte uma pequena porção do gel a partir de apenas acima da banda corante OrangeG para o fundo que contém o padrão de ₆ IP e uma pista de amostra, conforme mostrado na Figura 1.
2. Mancha a parte cortada do gel com Azul de Toluidina (0,1% (w / v) azul de toluidina, 20% (w / v) metanol, 2% (w / v) de glicerol) por alguns minutos (1-3 min) ou até que a banda pirofosfato inositol aparece. Coloque a placa de vidro previamente removido de volta ao topo do gel para evitar o gel imaculada de secagem.

A banda ₇ IP devem ser visíveis, uma vez que é executado um pouco mais lento do que o padrão de ₆ IP. ATP, que corre mais rápido do que ₆ IP, também deve ser visível (Figura 1). Transferir a parte manchada do gel em uma solução de coloração (20% (w / v) metanol) por alguns minutos, lave o excesso de azul de toluidina e reposicionar o gel com o gel imaculada.

Se a visualização de maior pyrophosphorylated isoformas inositol (IP ₈ e IP ₉₎ é exigido, a mancha do gel com azul de toluidina solução corante por 20 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente, lavar o azul de toluidina com a solução de coloração para cerca de 15 minutos.

3. Com uma lâmina de corte da banda ₇ IP na parte imaculada do gel utilizando como referência a posição migração IP ₇ determinada com o gel corado (Figura 1).
4. Colocar a banda ₇ IP que foi cortada do gel em um tubo de 15 mL e adicionar 10 mL de MilliQ DDH ₂ O. Coloque os tubos em rotação por 10 minutos em temperatura ambiente. Descartar o líquido para remover o excesso de partículas de acrilamida TBE e microscópicas.
5. Posteriormente, realizar duas desidratação-hidratação ciclos. Adicionar 5 mL de 50% (w / v) metanol para o tubo com o gel contendo ₇ IP e rodar em temperatura ambiente por 2 horas. Transferência do gel para um tubo de 15 mL novo contendo 5 mL de MilliQ DDH ₂ O e gire em temperatura ambiente por 2 horas. Não descarte o metanol e MilliQ H ₂ O a partir dos tubos. Repita o ciclo de desidratação-hidratação, uma vez mais por re-transferência de gel de poliacrilamida a nos 15 tubos mL usado anteriormente. Uma das lavagens podem ser realizadas durante a noite.
6. Para concentrar o IP eluída _7, secar a 10 mL em conjunto (5 mL MilliQddH ₂ O e 5 mL de metanol 50% (w / v)), utilizando um SpeedVac aquecida a 60 ° C.
7. Uma vez que as amostras são quase seco, transferir o líquido restante (300-600 mL) para A1.5 tubo de centrifugação mL e girar durante 2 minutos a 5000 rpm.
8. Recolher o sobrenadante e transferir para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL; deixara 20-30 mL de fundo, pois pode conter partículas de acrilamida.
9. Se necessário continuar o processo de secagem usando um SpeedVac sem aquecimento. A recuperação do IP ₇ é drasticamente reduzido se as amostras secar completamente, portanto, finalizar o processo de secagem quando as amostras atingir o volume de 100-300 mL.

4. Determinação da concentração de ₇ IP e pureza.

1. Use 2-5 mL da amostra recuperada IP ₇ para executar em um gel de PAGE, à semelhança do Seções 2.2-2.5. Carregar várias diluições de IP ₆ (ie 0,5, 1, 2, 4 nmol) como padrão de concentração e 4 nmol de Poly-P marcador. Depois de executar o gel, visualize as isoformas pirofosfato inositol por coloração e coloração de-gel com toda a solução de toluidina azul, seguindo o procedimento descrito na Seção 3.2 (Figura 2A).
2. Após a coloração toluidina, as concentrações podem ser determinadas por varredura do gel e comparar as diferenças de intensidade entre ₆ IP e IP _7, utilizando o software de imagem, como J-Imagem, como mostrado na Figura 2B.

5. Resultados representativos:

A conversão enzimática de preparativa IP _{6 e} IP ₇ usando enzimas IP ₆ K1 e VIP1 pode ser facilmente resolvida através da análise PAGE (Figura 1). O carregamento de _seis IP como um controle de tamanho juntamente com Toluidina coloração azul gel permite a identificação dos derivados pyrophosphorylated, uma vez que ficar mais lento, dependendo do número de grupos fosfatos presentes no anel de inositol. O procedimento descrito acima permite a purificação fácil de ₇ de IP. A análise do pirofosfato purificada inositol por PAGE revelou a pureza do nosso IP ₇ (Figura 2A). Curiosamente, a 1/3PP-IP ₅ isômero do produto ₇ de IP VIP1 migra ligeiramente mais lento do que o IP ₅ 5pp-isômero de ₇ de IP que é gerado pelo IP ₆ K1. Uso de IP ₆ padrões permitem uma quantificação mais fácil da concentração do IP purificada ₇ (Figura 2B). Antes de usar _sete IP para novas experiências, sua atividade biológica pode ser avaliada
(Figura 3). 5pp-IP ₅ é incubada com VIP1 e com a fosfatase ₇ IP DDP1 (diphosphoinositol phosphohydrolase polifosfato). Rotineiramente, o IP purificada _sete é convertido para IP ₈ por VIP1 e IP ₆ por DDP1 (Figura 3).

Figura 1:. Coloração Toluidina de PAGE e isolamento da banda ₇ IP A porção do gel contendo o padrão (IP ₆₎ foi cortado e corado usando uma solução de azul de toluidina. As três bandas representam (de cima para baixo) IP _7, IP ₆ e ATP. A parte manchada do gel foi, então, alinhado com o restante do gel. Isso permite que a localização da parte do gel contendo ₇ IP, que pode então ser cortada e purificada (caixa tracejada).

Figura 2: Análise PAGE dos produtos de reacção IP ₆ K1 e VIP1. A) Análise de IP ₆ (4, 2, 1, 0,5 nmol) pela coloração azul de toluidina foi utilizado para determinar a concentração de ₇ IP purificadas de ambas ₆ K1 IP (IP-5pp ₅₎ e VIP1 (1/3PP-IP ₅₎ reações. B) Dispersão análise para determinar a concentração do IP purificada _7. As concentrações foram determinadas de acordo com a intensidade da banda, calculado utilizando o software ImageJ, em comparação com quantidades pré-determinadas de ₆ de IP. O eixo X representa intensidades, o eixo Y representa a concentração expressa em nmol.

Figura 3:. Análise da atividade ₇ IP biológica Para determinar a qualidade do IP purificada _sete nós incubadas 5pp-IP ₅ (IP ₆ IP K1 gerados ₇₎ com VIP1 ou com a fosfatase ₇ IP DDP1 e então resolvida a reação na página. A coloração DAPI e toluidina revelou a produção esperada de ₈ por IP VIP1 ea conversão do IP ₇ a ₆ por IP DDP1.

Discussion

O uso de pirofosfato de inositol em bioquímica é severamente limitada pela indisponibilidade comercial de tais compostos ea pouca sensibilidade dos métodos de detecção existentes. A combinação de PAGE, que permite a separação de moléculas que possuem número diferente de grupos fosfato e Azul de Toluidina (Figura 1), um corante metacromática que se liga aos grupos fosfato, permite a fácil detecção de isoformas pyrophoshate inositol abrindo novos caminhos de pesquisa ^20.

O uso da tecnologia descrita PAGE para purificar produtos pirofosfato inositol da reação enzimática realizada outby ou ₆ IP K1 ou VIP1 é um método simples, econômico e confiável, que permite a produção de grandes quantidades de IP de alta qualidade _7. O método descrito acima não se limita à simples purificação do IP _7, mas pequenas modificações do protocolo descrito podem permitir a purificação de uma gama diferente de pirofosfatos inositol. Maior fosforilada isoformas pirofosfato inositol, contendo mais de oito grupos de fosfato pode ser detectada usando IP ₇ ou diferentes quantidades de ₆ IP como substrato ^20,6. Estes pirofosfatos inositol pode ser detectado através do aumento da duração do processo de coloração e posteriormente purificada (seção 3.2). Além disso, o uso de ₅ IP como substrato para a reação enzimática permitiria a purificação do PP-IP ₅ e outras pirofosfatos inositol contendo um grupo hidroxila no anel inositol.

Em conclusão, este método permite pouco exigente para a purificação de confiança de quantidades miligrama de pirofosfatos inositol com instrumentos amplamente disponível, abrindo novos caminhos para esse campo de pesquisa emocionante.

Materials

Phytic Acid (IP<sub>6</sub>)	Sigma-Aldrich	P8810
Poly-P (sodium hexametaphosphate)	Sigma-Aldrich	P8510
ATP-Mg<sup>2+</sup> salt	Sigma-Aldrich	A9187
OrangeG	Sigma-Aldrich	O3756
PhosphoCreatine (PCr)	Sigma-Aldrich	P7936
CreatinePhospho Kinase (CPK)	Sigma-Aldrich	C3755
His-Ddp1	Available in lab	Available in lab
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%)	Flowgen	H16972
Ammonium Persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A9164
Tris/Borate/EDTA (TBE)	Sigma-Aldrich	T 9060
Temed	VWR	43083G
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	198161
SpeedVac	Christ	100218
Gel apparatus	Hoeffer Scientific Instruments	SE600
Vacuum manifold	Christ	Alpha 2-4
Vacuum pump	ABM Greiffenberger	4EKF63CX