Preparação de Qualidade pirofosfatos Inositol

O objetivo geral deste procedimento é gerar e purificar pirofosfato de boa qualidade e nool. Isso é feito primeiro usando o IP seis como substrato para a IP seis quinase, uma enzima para gerar o IP sete. Em seguida, as reações enzimáticas são carregadas em um gel de poliamida e a banda correspondente ao IP sete é excisada.

O IP sete é então isolado por ciclos de hidratação de desidratação subsequentes. A etapa final do procedimento é confirmar a pureza do produto e determinar a concentração. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a atividade biológica do IP sete por meio da incubação do IP sete.

Com VIP uma quinase e com IP sete fosfatase DDP uma, essas reações geram IP oito e IP seis, respectivamente. Faça isso O Met pode fornecer informações sobre a sinalização IP sete. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como em parte de fosfatos como IP oito ou o IP cinco derivado PPIP quatro.

Este protocolo começa com a preparação de reações enzimáticas nas quais IP seis quinase um ou VIP um convertem IP seis para as isoformas relacionadas ao pirofosfo. Para esta demonstração, as enzimas IP seis marcadas com histamina, quinase um e VIP um marcadas com GST foram purificadas de e coli de acordo com um procedimento descrito anteriormente. Para começar, prepare 10 a 20 reações enzimáticas independentes contendo IP seis e seu IP seis quinase um ou GST VIP um, conforme descrito no protocolo escrito.

Ajuste o volume para 50 microlitros com água bidestilada milli Q. Depois de girar brevemente os tubos, incube as reações a 37 graus Celsius durante a noite com rotação. Prepare o aparelho de gel de poliacrilamida usando placas de vidro de 24 centímetros de comprimento, 18 centímetros de largura, espaços de 1,5 milímetro de largura e um pente de 16 pistas.

Em seguida, despeje uma solução de gel previamente preparada entre as placas de vidro pré-moldadas a um volume de 50 mililitros por gel. Insira o pente e deixe o gel polimerizar por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente. Uma vez polimerizado o gel, transfira o aparelho para a câmara fria.

Pré-execute o gel em uma TBE de uma vez por cerca de 30 a 60 minutos a 200 a 300 volts, enquanto isso em uma vez corante G laranja. Para cada reacção, preparar uma amostra de controlo padrão contendo dois mol de IP seis. Após a pré-corrida, lave bem cada poço com tampão de corrida.

Usando uma seringa presa a uma agulha de calibre 21 para remover qualquer precipitado. Em seguida, carregue as amostras no gel, evitando carregar as duas primeiras e as duas últimas pistas do gel. Finalmente, execute o gel durante a noite a sete miliamperes por gel até que a banda de corante G laranja esteja dentro dos últimos 10 centímetros da parte inferior do gel.

Para iniciar o isolamento do IP sete, desmonte o aparelho de gel e remova cuidadosamente uma placa de vidro deixando o gel na outra. Corte uma pequena porção do gel logo acima da banda GD laranja até a parte inferior, incluindo o padrão IP seis e uma pista de amostra. Manchar a parte cortada do gel com azul de toluidina por alguns minutos até que a banda de pirofosfato de anatol apareça.

Enquanto isso, coloque a placa de vidro removida anteriormente de volta em cima do gel para evitar que o gel não manchado seque. Transfira a parte corada do gel para uma solução de coloração DES por alguns minutos para remover qualquer excesso de azul de toluidina e, em seguida, reposicione o gel com o gel não corado. A banda IP sete deve estar visível, pois é um pouco mais lenta que o padrão IP seis, um TP, que funciona mais rápido que o IP seis, também deve estar visível.

Em seguida, use uma lâmina de barbear para cortar a faixa IP sete na parte não manchada do gel. Explore a posição migratória IP sete determinada com o gel de coloração. Para estimar a localização da banda IP sete, coloque a banda IP sete que foi cortada do gel em um tubo de 15 mililitros e adicione 10 mililitros de água bidestilada mili Q.

Gire os tubos por 10 minutos em temperatura ambiente após a incubação, descarte o líquido por decantação para remover o excesso de TBE e partículas microscópicas de acrilamida. Em seguida, execute dois ciclos de hidratação por desidratação, adicionando primeiro cinco mililitros de 50% de metanol ao tubo que contém o gel IP sete. Girar a amostra à temperatura ambiente durante duas horas.

Em seguida, transfira a fatia de gel para um novo tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de água bidestilada mili Q e gire em temperatura ambiente por duas horas. Manter o tubo contendo metanol para uso posterior após a incubação. Repita o ciclo de hidratação por desidratação mais uma vez para concentrar o IP sete eluído.

Combine os cinco mililitros de água adicionados anteriormente e cinco mililitros de 50% de metanol. Seque a solução combinada usando um aspirador rápido aquecido a 60 graus Celsius. Quando as amostras estiverem quase secas, transfira o líquido restante para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Gire o tubo por dois minutos de 5.000 rotações por minuto. Colete o SUP Transfira a amostra para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Se necessário, continue o processo de secagem usando um aspirador rápido não aquecido. A recuperação do IP sete é drasticamente reduzida se as amostras secarem completamente. Portanto, é imperativo encerrar o processo de secagem quando as amostras atingirem o volume de 100 a 300 microlitros.

Uma vez recuperado o IP sete isolado, coloque de dois a cinco microlitros da amostra em um gel de página para determinar sua concentração e pureza. Carregue várias diluições de IP seis como padrões de concentração e quatro mol de marcador de pólipo. Depois de executar o gel, visualize as isoformas iniciais de pirofosfato colorindo e descolorando todo o gel com solução de azul de toluidina.

Seguindo o procedimento que acabamos de descrever após a coloração com toluidina, as concentrações podem ser determinadas por varredura do gel e comparando as diferenças de intensidade entre IP seis e IP sete. Usando software de imagem como o Image J, a conversão enzimática preparativa de IP seis para IP sete. O uso das enzimas IP seis quinase uma e VIP uma pode ser facilmente resolvido usando a análise de página.

O carregamento de IP seis como controle de tamanho juntamente com a coloração com gel de azul de toluidina permite a identificação dos derivados pirofosforilados. Como eles são mais lentos, dependendo do número de grupos fosfato presentes na inicial, o procedimento descrito acima resultou na fácil purificação do IP sete. Além disso, a análise do pirofosfato de anatol purificado por página revelou a pureza do IP sete.

Curiosamente, os três isômeros IP cinco de pirofosfato do produto IP sete de VIP um migram um pouco mais devagar do que os cinco isômeros IP cinco de pirofosfato de VIP sete que são gerados por IP seis quinase um. O uso de padrões IP seis permite uma fácil quantificação da concentração do IP sete purificado antes do uso do IP sete. Para experimentos posteriores, sua atividade biológica pode ser avaliada. Cinco.

O pirofosfato IP cinco é incubado com FIP um e com o IP sete fosfatase DDP um rotineiramente. O IP purificado sete é convertido em IP oito por VIP um e em IP seis por DDP um. Após este procedimento, outros métodos, como uma coloração prolongada de tolin em azul, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como isolamento de IP oito ou outras formas fosforiladas em isoformas.