Name: Preparação de Qualidade pirofosfatos Inositol (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprenda a produzir e purificar pirofosfatos de inositol de alta qualidade, especificamente IP sete, usando reações enzimáticas e eletroforese em gel. Este método facilita pesquisas sobre sinalização celular e doenças humanas.

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Agradecemos a A. Riccio pelos comentários úteis e de ler o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Médica de financiamento (MRC) para a Unidade de Biologia Celular e por um Human Frontier Ciência Grant Program (RGP0048/2009-C).

1. Reação enzimática - 1 º dia (1 hora da tarde) <ol><li> O primeiro passo é preparar 20/10 independentes reações enzimáticas em que IP 6 K1 ou VIP1 converter IP 6 e as isoformas pyrophosphorylated. </li><li> Usamos His-IP 6 K1 e GST-Vip1 enzimas purificada de E. coli acordo com o protocolo descrito anteriormente 17,18. </li><li> Prepare 50 mL reações contendo 1X tampão de reação (30 mM Hepes pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM fosfocreatina (PCr), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg sal), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 mg His-IP 6 K1 ou GST-Vip1. Ajustar o volume com MiliQ DDH 2 O. </li><li> Brevemente girar a reação e incubar a 37 ° C durante a noite com rotação. </li></ol> 2. Fundição em gel de poliacrilamida e carregamento - dia 2 (4 horas da tarde) <ol><li> O gel de poliacrilamida é preparada usando 24 cm de comprimento, 18 cm de largura e placas de vidro 1,5 milímetros espaçadores de largura. Geralmente uma faixa de 16 ou um preparativo comb única pista é usada. </li><li> Prepare uma mistura (50 mL / gel) contendo o seguinte: 35,5% (w / v) acrilamida: bis-acrilamida 19:1, persulfato de amônio 1X Tris / Borato / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) (APS ), 0,05% (w / v) Temed. Despeje a mistura entre o pré-fundido placas de vidro, coloque o pente e deixar polimerizar por 30-60 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Uma vez que o gel tem polimerizado, a transferência do aparelho para a sala fria e pré-executado em TBE 1X por cerca de 30-60 minutos a 200-300 Volts. </li><li> Adicionar 1X de OrangeG corante (10 mM Tris-HCl pH 7,0, EDTA 1 mM, glicerol 30%, 0,1 OrangeG%) para cada reação. Preparar uma amostra contendo 2 nmol de IP 6 para carregar como um controle padrão. </li><li> Lavar cada cavidade completamente com tampão de corrida usando uma seringa e uma agulha 21G para remover qualquer precipitado, em seguida, carregar o gel. Evitar carregar nos poços de lado. </li><li> Executar o gel durante a noite a 450-550 volts (7 mAmp / gel), até que a banda corante OrangeG é nos últimos 10 cm da parte inferior do gel. </li></ol> 3. Isolamento do IP 7 - dia 3 (4 horas) e dia 4 (6-7 processo SpeedVac hora de secagem) <ol><li> Desmontar o aparelho gel e remova cuidadosamente uma placa de vidro deixando o gel sobre o outro. Corte uma pequena porção do gel a partir de apenas acima da banda corante OrangeG para o fundo que contém o padrão de 6 IP e uma pista de amostra, conforme mostrado na Figura 1. </li><li> Mancha a parte cortada do gel com Azul de Toluidina (0,1% (w / v) azul de toluidina, 20% (w / v) metanol, 2% (w / v) de glicerol) por alguns minutos (1-3 min) ou até que a banda pirofosfato inositol aparece. Coloque a placa de vidro previamente removido de volta ao topo do gel para evitar o gel imaculada de secagem. </li></ol> A banda 7 IP devem ser visíveis, uma vez que é executado um pouco mais lento do que o padrão de 6 IP. ATP, que corre mais rápido do que 6 IP, também deve ser visível (Figura 1). Transferir a parte manchada do gel em uma solução de coloração (20% (w / v) metanol) por alguns minutos, lave o excesso de azul de toluidina e reposicionar o gel com o gel imaculada. Se a visualização de maior pyrophosphorylated isoformas inositol (IP 8 e IP 9) é exigido, a mancha do gel com azul de toluidina solução corante por 20 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente, lavar o azul de toluidina com a solução de coloração para cerca de 15 minutos. <ol start="3"><li> Com uma lâmina de corte da banda 7 IP na parte imaculada do gel utilizando como referência a posição migração IP 7 determinada com o gel corado (Figura 1). </li><li> Colocar a banda 7 IP que foi cortada do gel em um tubo de 15 mL e adicionar 10 mL de MilliQ DDH 2 O. Coloque os tubos em rotação por 10 minutos em temperatura ambiente. Descartar o líquido para remover o excesso de partículas de acrilamida TBE e microscópicas. </li><li> Posteriormente, realizar duas desidratação-hidratação ciclos. Adicionar 5 mL de 50% (w / v) metanol para o tubo com o gel contendo 7 IP e rodar em temperatura ambiente por 2 horas. Transferência do gel para um tubo de 15 mL novo contendo 5 mL de MilliQ DDH 2 O e gire em temperatura ambiente por 2 horas. Não descarte o metanol e MilliQ H 2 O a partir dos tubos. Repita o ciclo de desidratação-hidratação, uma vez mais por re-transferência de gel de poliacrilamida a nos 15 tubos mL usado anteriormente. Uma das lavagens podem ser realizadas durante a noite. </li><li> Para concentrar o IP eluída 7, secar a 10 mL em conjunto (5 mL MilliQddH 2 O e 5 mL de metanol 50% (w / v)), utilizando um SpeedVac aquecida a 60 ° C. </li><li> Uma vez que as amostras são quase seco, transferir o líquido restante (300-600 mL) para A1.5 tubo de centrifugação mL e girar durante 2 minutos a 5000 rpm. </li><li> Recolher o sobrenadante e transferir para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL; deixara 20-30 mL de fundo, pois pode conter partículas de acrilamida. </li><li> Se necessário continuar o processo de secagem usando um SpeedVac sem aquecimento. A recuperação do IP 7 é drasticamente reduzido se as amostras secar completamente, portanto, finalizar o processo de secagem quando as amostras atingir o volume de 100-300 mL. </li></ol> 4. Determinação da concentração de 7 IP e pureza. <ol><li> Use 2-5 mL da amostra recuperada IP 7 para executar em um gel de PAGE, à semelhança do Seções 2.2-2.5. Carregar várias diluições de IP 6 (ie 0,5, 1, 2, 4 nmol) como padrão de concentração e 4 nmol de Poly-P marcador. Depois de executar o gel, visualize as isoformas pirofosfato inositol por coloração e coloração de-gel com toda a solução de toluidina azul, seguindo o procedimento descrito na Seção 3.2 (Figura 2A). </li><li> Após a coloração toluidina, as concentrações podem ser determinadas por varredura do gel e comparar as diferenças de intensidade entre 6 IP e IP 7, utilizando o software de imagem, como J-Imagem, como mostrado na Figura 2B. </li></ol> 5. Resultados representativos: A conversão enzimática de preparativa IP 6 e IP 7 usando enzimas IP 6 K1 e VIP1 pode ser facilmente resolvida através da análise PAGE (Figura 1). O carregamento de seis IP como um controle de tamanho juntamente com Toluidina coloração azul gel permite a identificação dos derivados pyrophosphorylated, uma vez que ficar mais lento, dependendo do número de grupos fosfatos presentes no anel de inositol. O procedimento descrito acima permite a purificação fácil de 7 de IP. A análise do pirofosfato purificada inositol por PAGE revelou a pureza do nosso IP 7 (Figura 2A). Curiosamente, a 1/3PP-IP 5 isômero do produto 7 de IP VIP1 migra ligeiramente mais lento do que o IP 5 5pp-isômero de 7 de IP que é gerado pelo IP 6 K1. Uso de IP 6 padrões permitem uma quantificação mais fácil da concentração do IP purificada 7 (Figura 2B). Antes de usar sete IP para novas experiências, sua atividade biológica pode ser avaliada (Figura 3). 5pp-IP 5 é incubada com VIP1 e com a fosfatase 7 IP DDP1 (diphosphoinositol phosphohydrolase polifosfato). Rotineiramente, o IP purificada sete é convertido para IP 8 por VIP1 e IP 6 por DDP1 (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Coloração Toluidina de PAGE e isolamento da banda 7 IP A porção do gel contendo o padrão (IP 6) foi cortado e corado usando uma solução de azul de toluidina. As três bandas representam (de cima para baixo) IP 7, IP 6 e ATP. A parte manchada do gel foi, então, alinhado com o restante do gel. Isso permite que a localização da parte do gel contendo 7 IP, que pode então ser cortada e purificada (caixa tracejada). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Análise PAGE dos produtos de reacção IP 6 K1 e VIP1. A) Análise de IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) pela coloração azul de toluidina foi utilizado para determinar a concentração de 7 IP purificadas de ambas 6 K1 IP (IP-5pp 5) e VIP1 (1/3PP-IP 5) reações. B) Dispersão análise para determinar a concentração do IP purificada 7. As concentrações foram determinadas de acordo com a intensidade da banda, calculado utilizando o software ImageJ, em comparação com quantidades pré-determinadas de 6 de IP. O eixo X representa intensidades, o eixo Y representa a concentração expressa em nmol. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3:. Análise da atividade 7 IP biológica Para determinar a qualidade do IP purificada sete nós incubadas 5pp-IP 5 (IP 6 IP K1 gerados 7) com VIP1 ou com a fosfatase 7 IP DDP1 e então resolvida a reação na página. A coloração DAPI e toluidina revelou a produção esperada de 8 por IP VIP1 ea conversão do IP 7 a 6 por IP DDP1.

<ol><li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+metabolism+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li>
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<li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li>
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<li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O uso de pirofosfato de inositol em bioquímica é severamente limitada pela indisponibilidade comercial de tais compostos ea pouca sensibilidade dos métodos de detecção existentes. A combinação de PAGE, que permite a separação de moléculas que possuem número diferente de grupos fosfato e Azul de Toluidina (Figura 1), um corante metacromática que se liga aos grupos fosfato, permite a fácil detecção de isoformas pyrophoshate inositol abrindo novos caminhos de pesquisa 20. O uso da tecnologia descrita PAGE para purificar produtos pirofosfato inositol da reação enzimática realizada outby ou 6 IP K1 ou VIP1 é um método simples, econômico e confiável, que permite a produção de grandes quantidades de IP de alta qualidade 7. O método descrito acima não se limita à simples purificação do IP 7, mas pequenas modificações do protocolo descrito podem permitir a purificação de uma gama diferente de pirofosfatos inositol. Maior fosforilada isoformas pirofosfato inositol, contendo mais de oito grupos de fosfato pode ser detectada usando IP 7 ou diferentes quantidades de 6 IP como substrato 20,6. Estes pirofosfatos inositol pode ser detectado através do aumento da duração do processo de coloração e posteriormente purificada (seção 3.2). Além disso, o uso de 5 IP como substrato para a reação enzimática permitiria a purificação do PP-IP 5 e outras pirofosfatos inositol contendo um grupo hidroxila no anel inositol. Em conclusão, este método permite pouco exigente para a purificação de confiança de quantidades miligrama de pirofosfatos inositol com instrumentos amplamente disponível, abrindo novos caminhos para esse campo de pesquisa emocionante.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Ácido fítico (IP 6) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> Poli-P (hexametafosfato de sódio) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP-Mg 2 + sal </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> Fosfocreatina (PCr) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> Quinase CreatinePhospho (CPK) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST-Vip1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> His-IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> His-Ddp1 </td><td> Disponível em laboratório </td><td> Disponível em laboratório </td></tr><tr><td> Acrilamida: bis-acrilamida 19:01 (40%) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> Persulfato de amônio (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> Tris / Borato / EDTA (TBE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> Temed </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Azul de Toluidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Cristo </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> Aparelho de gel </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> Colector de vácuo </td><td> Cristo </td><td> Alpha 04/02 </td></tr><tr><td> Bomba de vácuo </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

preparação de qualidade pirofosfatos inositol

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol está presente na natureza ou não modificado ou mais complexos derivados fosforilados. Do último, os dois mais abundantes nas células eucarióticas são pentakisphosphate inositol (IP 5) e hexakisphosphate inositol (ácido fítico ou IP 6). IP 5 e IP 6 são os precursores de moléculas de pirofosfato inositol que contêm uma ou mais ligações pirofosfato 1. Fosforilação de IP 6 gera diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 ou PP-PI 5) e bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 ou (PP) 2 IP-4). Pirofosfatos inositol foram isolados de todos os organismos eucarióticos, até agora estudados. Além disso, as duas classes distintas de enzimas responsáveis ​​pela síntese de pirofosfato inositol são altamente conservadas ao longo da evolução 2-4. O IP 6 quinases (IP 6 Ks) possuem uma enorme flexibilidade catalítico, convertendo IP 5 e IP 6 a PP-IP 4 e IP 7, respectivamente e, posteriormente, usando estes produtos como substratos, promover a geração de moléculas mais complexas 5,6 . Recentemente, uma segunda classe de enzimas gerando pirofosfato foi identificada na forma da proteína de levedura VIP 1 (também conhecido como PP-PI 5 K), que é capaz de converter IP 6 e IP 7 e 8 IP 7,8. Pirofosfatos inositol regular muitas diferentes processos celulares, tais como a secreção de insulina, 9 de telômeros de comprimento 10,11, quimiotaxia, 12 de tráfico vesicular 13, 14 e homeostase do fosfato HIV-1 gag release 15. Dois mecanismos de ação têm sido propostos para esta classe de moléculas. Eles podem afetar a função celular por alostericamente interagir com proteínas específicas como a AKT 16. Alternativamente, o grupo pirofosfato pode doar um fosfato de pré-fosforilada proteínas 17. O enorme potencial deste campo de pesquisa é dificultada pela ausência de uma fonte comercial de pirofosfatos inositol, que está impedindo que muitos cientistas de estudar essas moléculas e esta modificação pós-translacional novo. Os métodos actualmente disponíveis para isolar pirofosfatos inositol exigem aparato cromatográfico sofisticado 18,19. Estes procedimentos utilizam condições ácidas que podem levar à degradação pirofosfato inositol 20 e, assim, para a recuperação pobres. Além disso, o incômodo procedimentos pós-coluna dessalinização restringir seu uso aos laboratórios especializados. Neste estudo, descrevemos um método pouco exigente para a geração de isolamento e purificação dos produtos do IP 6-quinase e PP-IP 5-quinases reações. Este método foi possível pela capacidade de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver altamente fosforilada polifosfatos inositol 20. Após IP 6 K1 e PP-IP 5 reações enzimáticas K usando 6 IP como substrato, PAGE foi usada para separar o pirofosfatos gerada inositol, que foram posteriormente eluídos em água.

Pirofosfatos inositol desempenhar um papel importante em patologias humanas como câncer, diabetes e obesidade, no entanto, o mecanismo exato de ação é uma questão de disputa. A falta de disponível comercialmente pirofosfatos inositol estudos detalhados torna problemática. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para produzir e isolar miligramas de pirofosfatos inositol.

Preparação de Qualidade pirofosfatos Inositol

O mio-inositol está presente na natureza seja de forma não modificada, seja em derivados fosforilados mais complexos. Destes últimos, os dois mais abundantes em células eucarióticas...

O objetivo geral deste procedimento é gerar e purificar pirofosfato de inositol de boa qualidade. Isso é realizado primeiramente utilizando IP seis como substrato para a IP seis quinase, uma enzima que gera IP sete. Em seguida, as reações enzimáticas são carregadas em um gel de poliamida e a banda correspondente ao IP sete é recortada.O IP sete é então isolado por ciclos subsequentes de desidratação e hidratação. O passo final do procedimento é confirmar a pureza do produto e determinar a concentração. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a atividade biológica do IP sete por meio da incubação com o IP sete.Com VIP uma quinase e com o IP sete fosfatase DDP um, essas reações geram IP oito e IP seis, respectivamente. Fazer isso pode fornecer informações sobre a sinalização do IP sete. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como na parte de fosfatos como IP oito ou o PPIP quatro derivado do IP cinco.Este protocolo inicia-se com o preparo de reações enzimáticas nas quais a inositol hexafosfato quinase um ou a VIP um convertem o IP seis em isoformas relacionadas a pirofosfatos. Para esta demonstração, o IP seis marcado com histidina, a quinase um do IP seis e as enzimas VIP um marcadas com GST foram purificadas de *E. coli* segundo um procedimento previamente descrito. Para começar, prepare 10 a 20 reações enzimáticas independentes contendo IP seis e a quinase um do IP seis com histidina ou a VIP um com GST, conforme descrito no protocolo escrito.Ajuste o volume para 50 microlitros com água duplamente destilada milli Q. Após centrifugar brevemente os tubos, incube as reações a 37 graus Celsius durante a noite com rotação. Prepare o equipamento de gel de poliacrilamida utilizando placas de vidro com 24 centímetros de comprimento, 18 centímetros de largura, espaçadores de 1,5 milímetro de largura e um pente de 16 poços.Em seguida, despeje uma solução de gel previamente preparada entre as placas de vidro pré-moldadas em um volume de 50 mililitros por gel. Insira o pente e deixe o gel polimerizar por 30 a 60 minutos à temperatura ambiente. Após a polimerização do gel, transfira o aparato para a câmara fria.Execute previamente o gel em TBE 1 vez por cerca de 30 a 60 minutos a 200 a 300 volts, simultaneamente em corante laranja G 1 vez. Para cada reação, prepare uma amostra controle padrão contendo dois mol de IP seis. Após a corrida prévia, lave cada poço cuidadosamente com o tampão de eletroforese.Utilizando uma seringa acoplada a uma agulha de 21 gauge, remova qualquer precipitado. Em seguida, carregue as amostras no gel, evitando as duas primeiras e as duas últimas fileiras do gel. Por fim, execute o gel durante a noite a sete miliampères por gel até que a faixa da corante laranja G esteja dentro dos últimos 10 centímetros da base do gel.Para iniciar o isolamento do IP sete, desmonte o equipamento de eletroforese e remova cuidadosamente uma placa de vidro, deixando o gel sobre a outra. Corte uma pequena porção do gel, desde logo acima da faixa laranja de GD até a extremidade inferior, incluindo o padrão de IP seis e uma trilha de amostra. Mergulhe a porção cortada do gel em azul de toluidina por alguns minutos até que a faixa de pirofosfato de Anatol apareça.Enquanto isso, coloque novamente a placa de vidro previamente removida sobre o gel para evitar que o gel não corado seque. Transfira a porção corada do gel para uma solução de coloração DES por alguns minutos, a fim de remover qualquer excesso de azul de toluidina, depois reposicione o gel com a parte não corada. A banda IP sete deve ser visível, já que ela migra ligeiramente mais devagar do que o padrão IP seis de A TP, que por sua vez migra mais rápido; o IP seis também deve ser visível.Em seguida, utilize uma lâmina de barbear para cortar a faixa do IP seven na porção não corada do gel. Utilize a posição de migração do IP seven determinada com o gel corado. Para estimar a localização da faixa do IP seven, coloque a faixa do IP seven que foi cortada do gel em um tubo de 15 mililitros e adicione 10 mililitros de água milli Q duplamente destilada.Rotacione os tubos por 10 minutos à temperatura ambiente após a incubação, descarte o líquido por decantação para remover o excesso de TBE e partículas microscópicas de acrilamida. Em seguida, realize dois ciclos de desidratação e hidratação adicionando primeiramente cinco mililitros de metanol 50% ao tubo contendo o gel IP sete. Rotacione a amostra à temperatura ambiente por duas horas.Em seguida, transfira o fragmento de gel para um novo tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de água duplamente destilada Milli-Q e agite em temperatura ambiente por duas horas. Guarde o tubo contendo metanol para uso posterior após a incubação. Repita o ciclo de desidratação e hidratação mais uma vez para concentrar o IP sete eluído.Combine os cinco mililitros de água e cinco mililitros de metanol 50% previamente adicionados. Seque a solução combinada utilizando um evaporador a vácuo aquecido a 60 graus Celsius. Assim que as amostras estiverem quase secas, transfira o líquido remanescente para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Centrifugue o tubo por dois minutos a 5.000 rotações por minuto. Colete o sobrenadante, deixando os 20 a 30 microlitros inferiores, pois podem conter partículas de acrilamida. Transfira a amostra para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Se necessário, prossiga o processo de secagem usando uma centrífuga a vácuo sem aquecimento. A recuperação do IP sete é drasticamente reduzida se as amostras secarem completamente. Portanto, é imperativo encerrar o processo de secagem quando as amostras atingirem o volume de 100 a 300 microlitros.Após a recuperação do IP sete isolado, carregue de dois a cinco microlitros da amostra em um gel de eletroforese para determinar sua concentração e pureza. Carregue várias diluições do IP seis como padrões de concentração e quatro mol do marcador de polipeptídeos. Após a corrida eletroforética, visualize as isoformas iniciais de pirofosfato corando e descorando todo o gel com solução de azul de toluidina.Após o procedimento descrito acima, com coloração por toluidina, as concentrações podem ser determinadas por meio da digitalização do gel e da comparação das diferenças de intensidade entre o IP seis e o IP sete. Utilizando um software de análise de imagens, como o Image J, a conversão enzimática preparativa de IP seis em IP sete, catalisada pelas enzimas IP seis quinase um e VIP um, pode ser facilmente resolvida por meio de análise em gel.A carga do IP seis como controle de tamanho, juntamente com a coloração do gel com azul de toluidina, permite a identificação dos derivados pirofosforilados. Como eles migram mais lentamente, dependendo do número de grupos fosfato presentes no inicial, o procedimento descrito acima resultou na fácil purificação do IP sete. Além disso, a análise do anatol pirofosfato purificado por eletroforese em gel revelou a pureza do IP sete.Curiosamente, o isômero de IP5 com um pirofosfato em posição três do produto IP7 da VIP1 migra ligeiramente mais lentamente do que o isômero de IP5 com pirofosfato em posição cinco gerado pela IP6 quinase 1. O uso de padrões de IP6 permite uma quantificação fácil da concentração de IP7 purificado antes de utilizá-lo em experimentos. Para experimentos adicionais, sua atividade biológica pode ser avaliada.O pirofosfato IP cinco é incubado com FIP um e com a fosfatase IP sete DDP um rotineiramente. O IP sete purificado é convertido em IP oito pela VIP um e em IP seis pela DDP um. Após este procedimento, outros métodos, como uma coloração prolongada com toluidina azul, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o isolamento de IP oito ou outras formas fosforiladas de isoformas.

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Research

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Biology

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