Ablação seletiva assistida por laser de células endoteliais da córnea suína: uma técnica para induzir lesão endotelial da córnea suína focada para estudos ex vivo

Neste artigo

Resumo

Fonte: Holzhey, A. et al., Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo assistido por laser de perda de células endoteliais da córnea. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra um procedimento não invasivo assistido por laser para danificar seletivamente as células endoteliais da córnea no olho suíno. O modelo ex vivo desenvolvido de dano às células endoteliais pode ser usado para estudar doenças do endotélio da córnea.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de cultura de órgãos e tratamento a laser

Obtenha olhos de suínos recém-enucleados no matadouro local. Mantenha-os frescos (4 °C) em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose, suplementado com L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina/estreptomicina (1%) e soro suíno (10%), doravante referido neste artigo como meio completo.
Remova os tecidos extracelulares com tesoura e mergulhe os olhos em solução oftálmica de iodopovidona a 5% por 5 minutos antes de colocá-los em solução salina tamponada com fosfato esterilizado (PBS) até o uso.
Examine os olhos em busca das principais patologias do segmento anterior, como cicatrizes na córnea, edema e outras opacidades com um dispositivo de tomografia de coerência óptica de domínio espectral (Tabela de Materiais).
Posicione os olhos na frente de uma unidade de lâmpada de fenda equipada com um laser Nd:YAG (Tabela de Materiais), que tem um comprimento de onda de 1.064 nm e um diâmetro de ponto focal de 10 μm no ar.
nota: Para um posicionamento ideal, é utilizado um aparelho de fixação impresso em 3D, projetado para manter o olho firme, sem colocar muita pressão sobre ele (Figura 1).
Use uma ampliação de 12x e desvie a iluminação para visualizar as camadas individuais da córnea.
Defina a energia de pulso (por exemplo, 1.6 mJ) e o ponto de foco (por exemplo, 0.16 mm) para ablação seletiva de células endoteliais.
Coloque uma paracentese da córnea transparente perto do limbo e injete viscoelástico (Tabela de Materiais) para estabilizar a câmara anterior.
Extirpar a córnea central tratada com laser com uma trefina de 8 mm.
Coloque a córnea excisada em um poço de uma placa de 12 poços com o local endotelial voltado para cima e incube a amostra em 3 mL de meio completo a 37 °C por até 3 dias.
nota: Potenciais agentes citoprotetores podem ser adicionados ao meio durante esta etapa.

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Resultados

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Figura 1: Configuração experimental.(A) Os olhos foram fixados em um aparelho de retenção parcialmente impresso em 3D, o que permitiu um alinhamento preciso em relação ao feixe de laser. (B) Antes do tratamento com laser, o tecido foi avaliado com um aparelho de tomografia de coerência óptica do segmento anterior para verificar as principais patologias do segmento an...