Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Animais e alojamento
- Adquira coelhos New Zealand White (NZW) pesando 2-3 kg.
- Alojar os coelhos individualmente em gaiolas com controle estrito de temperatura (65 ± 5 ° F) e umidade (45 ± 5%). A iluminação deve ter um ciclo de ligar/desligar de 12 horas.
- Fornece acesso ilimitado à água e ração padrão para coelhos. Elimine os enriquecimentos dietéticos, pois eles podem conter vitamina A que afeta os olhos.
- Aclimatar os animais por pelo menos 2 semanas antes das medidas iniciais ou indução de olho seco.
2. Métodos de anestesia e eutanásia
NOTA: Todos os procedimentos requerem sedação leve, exceto a injeção de Con A que requer sedação moderada.
- Para sedação leve, injete acepromazina (1 mg/kg) por via subcutânea sobre os ombros usando uma agulha de calibre 26. Ponto final para sedação leve: os animais mantêm uma posição relaxada da cabeça com os lóbulos das orelhas não mais totalmente eretos.
nota: Se o ponto final apropriado não for atingido, uma injeção adicional de acepromazina pode ser administrada. Os animais devem sempre permanecer acordados, responsivos ao toque de seus bigodes e nunca mostrar respiração lenta.
- Para sedação moderada, primeiro dê aos animais acepromazina como acima. Depois de atingido o ponto final (ver nota acima), administre isoflurano utilizando uma máscara de gás com fluxo de O2 definido para 1 L/min e administração de isoflurano definida para 5% (Figura 1).
- Administre isoflurano até que o tônus corporal do coelho esteja completamente relaxado e as orelhas estejam completamente flácidas.
nota: Nenhum movimento muscular compensatório deve ocorrer quando o animal é virado de lado; A respiração permanece sempre espontânea.
- A recuperação espontânea ocorre dentro de 2-5 minutos: os sinais incluem movimentos espontâneos da cabeça e tônus muscular aumentado ou normal. Após o procedimento experimental ser concluído com sedação moderada, observe os coelhos por cerca de 30 min ou até que seu comportamento volte ao normal.
nota: A pomada oftálmica não é necessária durante nenhuma das formas de sedação. 1) Na sedação leve, os animais ainda estão alertas e mantêm um reflexo de piscar. Na sedação moderada, a inibição do reflexo de piscar é tão curta que a superfície ocular não está em risco. 2) A colocação de pomada oftálmica na superfície ocular impede a visualização das estruturas avaliadas durante o teste.
- Eutanásia: Use uma overdose de pentobarbital intravenoso (100 mg / kg).
3. Indução e tratamento do olho seco
NOTA: Três porções do sistema da glândula lacrimal orbital são injetadas.
- Sedar os coelhos com acepromazina 0,2 mg/kg por via subcutânea.
- Corte o pelo na área periorbital e do couro cabeludo e remova completamente qualquer pelo residual usando Nair. Deixe a pele totalmente lisa para melhor visualização das características anatômicas e injeção guiada por US de concanavalina A (Figura 2).
- Induza sedação moderada conforme descrito acima.
- Injeção da porção palpebral da glândula lacrimal superior (PSLG)
nota: Execute a injeção de PSLG primeiro.
- Aplicar no olho apropriado 25 μL de lidocaína a 1% sem conservantes com uma micropipeta.
- Inverta a pálpebra superior e aplique uma leve pressão medial na borda orbital posterior até que a protuberância que marca a porção palpebral da glândula seja vista. O PSLG aparece como uma pequena elevação bulbosa na porção posterior (temporal) da pálpebra superior.
nota: Para visualizar o tecido da glândula durante o processo de aprendizagem, aplique 5% de fluoresceína na área (Figura 3A). Lágrimas podem ser vistas escorrendo do bulboso PSLG. A aplicação de fluoresceína não é necessária para a administração de Con A; É feito apenas para fins ilustrativos para mostrar o tecido da glândula.
- Usando uma pinça de dentes finos e uma agulha de calibre 27 em uma seringa de tuberculina, penetre diretamente na glândula usando uma abordagem transconjuntival. Avance a agulha 2 mm no tecido e injete 500 μg de Con A em um volume de 0,1 mL (Figura 3B).
NOTA: Esta injeção às vezes pode ser dolorosa. Se necessário, manter os animais sob isoflurano até que esta injecção esteja concluída.
