Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento de células endoteliais da aorta suína
- Em condições assépticas, remova a aorta de porco do tampão de lavagem e coloque-a em uma placa de Petri de 150 mm (Figura 1A).
- Corte suavemente as duas extremidades da aorta e excise o excesso de tecido ao redor da aorta com pinças estéreis e tesouras novamente (Figura 1B). Lave a parte externa e interna da aorta (sobre a placa de cultura em temperatura ambiente) com 20−50 mL de tampão de lavagem: 1x solução de PBS (pH 7,4) com 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina.
nota: Tente cortar apenas a área onde as pinças foram colocadas durante a cirurgia, pois alguns CEs foram danificados nessa área, e remova o excesso de tecidos e ramos laterais arteriais.
- Passe uma sutura cirúrgica pela aorta e, em seguida, amarre uma extremidade da aorta usando a sutura cirúrgica (5-0, 90cm, Tabela de Materiais). Mantenha a sutura cirúrgica no interior da aorta (Figura 1C,D).
- Fixe suavemente a aorta perto da extremidade amarrada com uma pinça e, em seguida, puxe a sutura cirúrgica lentamente para reverter a aorta até que a superfície endotelial da aorta esteja exposta (Figura 1E−G).
nota: Certifique-se de fixar a aorta perto da extremidade amarrada e não fixe a aorta com força, ou então a aorta não pode ser revertida puxando a sutura cirúrgica.
- Lave a superfície endotelial da aorta com tampão de lavagem 3x (10 mL por lavagem) e, em seguida, descarte esta solução. Colocar a aorta em um tubo de centrífuga de 15 mL e cobrir a aorta com 10 mL de solução digestiva de colagenase IV a 0,005% no tubo (Figura 1H).
nota: Pré-aqueça a solução digestiva IV de colagenase a 0,005% a 37 ° C antes da digestão.
- Incubar a 37 °C por 15 min. Coloque a aorta digerida e a solução digestiva em uma placa de cultura de 100 mm e interrompa os efeitos da colagenase IV a 0,005% adicionando 10 a 15 mL de tampão de parada pré-resfriado: meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de FBS inativado por calor e 1% de P/S.
nota: O tempo de digestão recomendado é entre 10 e 20 minutos. Certifique-se de que a superfície endotelial da aorta esteja coberta pelo tampão de parada.
- Raspe suavemente os pAECs da superfície interna da aorta usando um raspador de células ( Figura 1I ). Lave a aorta raspada 3x com tampão de lavagem (5 mL por vez). Colocar a solução da placa de cultura num tubo de centrifugação de 50 ml. Lave o fundo da placa de cultura 2x com tampão de lavagem (5 mL por vez) e coloque a solução em um tubo de centrífuga de 50 mL novamente.
nota: Raspe em uma direção suavemente e não comprima. Não toque no tecido perto das bordas e orifícios. Recomenda-se raspar 5−8x.
- Centrifugue o tubo a 600 x g durante 6 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e deixar 10 ml de solução no fundo de um tubo de centrifugação de 50 ml. Adicione 20 mL de tampão de lavagem ao tubo de centrifugação de 50 mL e ressuspenda os pellets. Evite bolhas durante esta etapa.
- Centrifugue a 600 x g durante 6 min a 4 °C. Rejeitar lentamente o sobrenadante. Ressuspenda os grânulos celulares com 1 mL de meio de cultura e misture bem.
nota: O número médio obtido de CEs por cm de aorta é de 1,9 x 10⁵ ± 1,4 x 10⁴ (média ± DP, n = 3).
- Conte as células com um contador de células. Plaquear e cultivar as células em um recipiente sem revestir nenhum material de acordo com o número da célula. Se o número de células for menor ou igual a 1,0 x 10⁶, cultivar células em um balão de 25 cm². Se o número de células for maior que 1,0 x 10⁶, cultive células em vários frascos de 25 cm² (1,0 x 10⁶ células por frasco). Colocar o frasco em uma incubadora (sem agitação) a 37 °C com 5% de CO₂ e substituir o meio a cada 2−3 dias.
nota: Algumas células são danificadas pelo raspador de células. Um ensaio de viabilidade celular constatou que a porcentagem de células vivas é de 95,7% ± 1,7% (média ± DP, n = 3). O tempo de duplicação das células isoladas é de cerca de 1 a 2 dias.
