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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento de Artérias Ciliares Posteriores Curtas
Olhos suínos juntamente com nervo óptico e tecidos extraoculares foram obtidos imediatamente post-mortem. Os olhos enucleados foram transportados para o laboratório em solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) e usados imediatamente.
NOTA: O olho suíno é basicamente dividido em seções anterior (Figura 1A) e posterior (Figura 1B).
- Coloque o globo ocular em uma câmara de dissecção contendo tampão Krebs-Henseleit (KH) gelado. Corte cuidadosamente os músculos e tecidos circundantes com uma tesoura Mayo afiada.
nota: Para preparar o tampão Krebs-Henseleit (KH), pese os seguintes produtos químicos (27,68 g de NaCl, 8,4 g de NaHCO, 3,1,4 g de KCl, 1,18 g de MgSO4 e 0,64 g de KH2PO4) em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL seco e limpo e 1,47 g de CaCl2 e 8,0 g de glicose em outro tubo. A mistura em pó desses produtos químicos deve ser armazenada em local fresco e seco. A mistura de CaCl2 e glicose em pó é melhor preparada fresca para evitar a absorção de umidade e aglomeração.
- Faça uma incisão com um bisturi e corte o globo ao longo do plano equatorial com uma tesoura Mayo afiada até que o olho seja separado nas metades anterior e posterior. Remova o máximo possível de corpo vítreo da metade posterior do olho usando um par de pinças de padrão padrão.
nota: A separação do globo ocular em duas metades facilita o isolamento das artérias ciliares posteriores curtas (sPCA) com facilidade, sem ter um olho em movimento na placa de dissecção. No entanto, esta etapa não é obrigatória. Os vasos também podem ser isolados sem abrir o globo ocular.
- Use pinos de dissecção para fixar cuidadosamente a metade posterior do olho com o lado da retina voltado para baixo e o nervo óptico voltado para cima em direção ao experimentador.
- Corte suavemente os tecidos conjuntivos ao redor do nervo óptico para expor a vasculatura retrobulbar subjacente com uma tesoura de mola Student Vannas.
- O sPCA pode ser visto como ramos curtos de vasos (entre 5-8 ramos) que penetram na esclera e circunferencialmente a cabeça do nervo óptico (Figura 1C). Isolar a SCAP paraóptica e distal juntamente com os tecidos conjuntivos circundantes com uma pinça de precisão tipo 5 e uma tesoura de capsulotomia Vannas (Figura 1D).
nota: Certifique-se de que o tampão KH permaneça gelado durante todo o procedimento de isolamento. É altamente recomendável trocar o buffer a cada 20-30 min, dependendo da temperatura ambiente.
2. Preparação da amostra
- Remova suavemente os tecidos conjuntivos dos segmentos arteriais usando pinças de precisão tipo 5 de ponta extra fina e tesouras de capsulotomia Vannas sob um estereomicroscópio e enxágue as artérias isoladas em PBS gelado para remover contaminantes e resíduos sanguíneos.
nota: Se as amostras não forem submetidas às próximas etapas imediatamente, congele-as em nitrogênio líquido e armazene-as a -80 °C até uso posterior.
