Vitrificação de embriões de coelho usando palha criogênica: uma técnica de resfriamento ultrarrápido para preservar embriões de coelho para armazenamento a longo prazo

Resumo

Fonte: Garcia-Dominguez, X. et al. Transferência minimamente invasiva de embriões e vitrificação de embriões no estágio ideal de embriões em modelo de coelho. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, descrevemos o procedimento de vitrificação de embriões de coelho colhidos no estágio de desenvolvimento desejado usando etilenoglicol e dimetilsulfóxido como crioprotetores e palha criogênica como sistema de transporte. Os embriões vitrificados têm alta taxa de sobrevivência e podem ser armazenados por um longo período até o uso.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Vitrificação de embriões

1. Realizar todas as manipulações à temperatura ambiente (cerca de 22 °C) para reduzir a toxicidade da solução de vitrificação a temperaturas mais quentes.
   nota: Os embriões podem ser movidos usando pipeta automática de 0,1 a 2 μL neste protocolo, mas outros dispositivos semelhantes para mover os embriões arrastando o volume mínimo podem ser adequados.
2. Vitrificar os embriões em um procedimento de adição em duas etapas:
   1. Colocar os embriões durante 2 minutos em solução equilibrante constituída por 10% (v/v) de etilenoglicol e 10% (v/v) de dimetilsulfóxido dissolvido em meio base (BM). (Composição do BM: Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementada com 0,2% (p / v) de albumina de soro bovino)
   2. Mova os embriões (da etapa 1.2.1) por 1 minuto para uma solução de vitrificação consistindo de 20% (v / v) de etilenoglicol e 20% (v / v) de dimetilsulfóxido dissolvido em BM.
3. Carregue os embriões em uma ministra de plástico de 0,25 mL (que contém uma extremidade fechada com um tampão de algodão e uma extremidade aberta). O processo está esquematizado na Figura 1.
   1. Acople a extremidade fechada de 0,25 mL de ministraw com o microdispensador apropriado (por exemplo, Captroll III).®
   2. Aspirar a MO até 1/3 do comprimento da palha, seguida de uma pequena bolha de ar.
   3. Aspirar os embriões em um volume de 40 μL de solução de vitrificação, seguido de outra pequena bolha de ar.
   4. Aspirar a MO até que a primeira fracção líquida (passo 1.3.2) atinja o algodão.
   5. Feche a extremidade aberta com um tampão de canudo.
4. Execute a etapa 1.2.2 enquanto a etapa 1.3 está sendo feita para garantir que não decorra mais de um minuto, o que seria tóxico para os embriões.
5. Mergulhe o ministério diretamente no nitrogênio líquido para obter a vitrificação.
6. Armazene o ministério em um dewar para nitrogênio pelo tempo desejado.

Resultados

Figura 1: Esquematização da palha carregada corretamente. A) MO refere-se ao meio de manipulação de embriões empregado durante a vitrificação. Os embriões devem ser carregados em solução de vitrificação. B) Aparência macroscópica do canudo carregado com detalhe ampliado da posição do embrião. Este dispositivo de grande volume nos permite vitrificar um grande número de embriões, ao c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino (BSA)	VWR	332
Dimetilsulfóxido	Sigma Aldrich	W387509
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773	Sem cloreto de cálcio.
etilenoglicol	Sigma Aldrich	102466-M
Nitrogênio líquido	Air Liquide	P1505XXX
Canudo de plástico 0,25 mL	IMV - tecnologias	Nº 6431
Estereomicroscópio	Leica	MZ16F	Existem opções mais baratas, como Leica MZ8 ou Nikon SMZ-10 ou SMZ-2B, para citar algumas.
Plugue de palha	IMV - tecnologias	Nº 6431