Transferência de embriões para coelhos: um procedimento para transferência de embriões guiada por laparoscopia para oviduto de modelo de coelho fêmea receptora ovulante

Resumo

Fonte: Garcia-Dominguez, X. et al., Transferência minimamente invasiva de embriões e vitrificação de embriões no estágio ideal de embrião em modelo de coelho. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo descreve a técnica de transferência de embriões para o oviduto de uma coelha receptora por meio de laparoscopia. Permite a remodelação embrionária em coelhos durante sua migração através do oviduto, eventualmente ajudando na implantação bem-sucedida. Esta técnica também pode ser usada para embriões armazenados com boa eficiência.

Protocolo

1. Transferência de embriões

1. Preparação das fêmeas receptoras
   1. Use apenas mulheres sexualmente maduras (> 4,5 meses de idade).
   2. Uma semana antes do TE, adapte as fêmeas a um regime de 16 h de luz / 8 h de escuridão para iniciar o crescimento folicular e aumentar a receptividade das fêmeas.
   3. Selecione as fêmeas receptoras, observando a turgidez e a cor da vulva. Se a vulva estiver túrgida e avermelhada, a fêmea é receptiva.
   4. Induza a pseudogravidez (ovulação) por uma única injeção intramuscular de 1 μg de acetato de burelina (análogo sintético do hormônio liberador de gonadotrofina), independentemente do peso corporal.
      NOTA: Normalmente, 0,8 μg é uma dose adequada para indução da ovulação em coelhos de tamanho médio (4-5 kg), portanto, 1 μg geralmente garante a ovulação.
   5. Induza a ovulação com tantos dias de antecedência quanto a idade dos embriões a serem transferidos (por exemplo, 70-72 h antes da mórula fresca ET).
2. Anestesia e analgesia
   1. Pese o coelho e carregue os seguintes anestésicos e analgésicos.
      1. Em seringa de 1 mL com agulha 30G: carregar xilazina (5mg/kg) e cloridrato de buprenorfina (0,03 mg/kg). Em outra seringa de 1 mL com agulha pericraniana 23G, coloque cloridrato de cetamina (35 mg/kg).
   2. Segure o coelho e injete a mistura de xilazina-buprenorfina por via intramuscular.
   3. Insira a agulha pericraniana com cetamina na veia marginal da orelha, introduzindo lentamente todo o conteúdo da seringa por via intravenosa.
   4. Fixe a agulha e deixe-a inserida ao longo das etapas restantes para administrar mais anestesia, se necessário.
   5. Deixe o coelho na gaiola (limpa e sem outros animais) em um palco quente.
   6. Uma vez inconsciente, aplique pomada ocular para evitar o ressecamento do olho e verifique a ausência do reflexo palpebral.
      nota: Este protocolo fornece um plano de anestesia cirúrgica por um mínimo de 30 min. Se for necessário um período de tempo mais longo, injetar doses adicionais com metade da quantidade de cloridrato de cetamina descrita em 1.2.1 após 30 minutos.
   7. Monitore a profundidade da anestesia verificando o reflexo pedal e o movimento respiratório. Alterações no padrão respiratório para uma frequência irregular e mais rápida indicam perda do plano adequado de anestesia.
   8. Monitore a cor das membranas mucosas (olhos, lábios, etc.), frequência respiratória (30-60 respirações por minuto), frequência cardíaca (120-325 batimentos por minuto) e temperatura retal (38-39,6 °C).
   9. Oito horas antes da transferência, retenha a comida dos animais para evitar o maior tamanho e atividade do intestino até que o processo de ET seja concluído. Deixe livre acesso à água.
3. Preparação de embriões
   1. Aqueça o meio de manipulação do embrião a 25 °C: Meio de Base (BM), consistindo de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementada com 0,2% (p/v) de albumina de soro bovino.
   2. Trabalhando sob um estereomicroscópio, enxágue os embriões frescos ou descongelados (Etapa 2) com BM.
   3. Usando luvas estéreis, conecte um cateter peridural 17G configurado adequadamente a uma seringa de 1 mL.
   4. Aspire 1 cm de MO no cateter, seguido por uma pequena bolha de ar.
   5. Aspirar 5-7 embriões em um volume de 10 μL de MO, seguido por outra pequena bolha de ar.
   6. Termine de carregar o cateter aspirando 1 cm de MO.
4. Transferência de embriões
   1. Considere o uso de luvas, aventais e máscaras estéreis para garantir um ambiente asséptico.
   2. Esterilize os instrumentos cirúrgicos, limpe as superfícies onde a cirurgia será realizada e limpe-as com etanol 70%.
   3. Realize a anestesia conforme detalhado anteriormente (etapa 1.2), verificando se há perda de reflexos.
   4. Raspe o pelo do abdômen ventral com um barbeador elétrico.
   5. Prepare o abdômen ventral assepticamente.
      1. Limpe a área cirúrgica e remova os pelos restantes. Lave a área cirúrgica com um sabonete de gluconato de clorexidina. Hissoricar a área com solução de clorexidina e etanol 96º (3 vezes).
   6. Coloque o animal em uma mesa cirúrgica quente, na posição de Trendelenburg (cabeça para baixo a 45°) para garantir que o estômago e os intestinos estejam localizados cranialmente. Considere a evacuação da bexiga se estiver túrgida. Se alguma víscera for danificada no processo, o animal pode morrer. Portanto, é importante tê-los localizados corretamente (Figura 1).
   7. Cubra a área com uma toalha estéril, com um orifício (fenestração) expondo a área raspada, para separar o local da cirurgia de quaisquer áreas potencialmente contaminantes.
   8. Insira um trocarte endoscópico de 5 cm na cavidade abdominal, 2 cm caudal ao apêndice xifóide, e insufle através dele a cavidade peritoneal com um insuflador mecânico regulador de pressão.
      nota: A pressão intra-abdominal deve ser de 8-12 mmHg com CO₂ (Figura 1A).
   9. Insira a câmera do endoscópio através do trocarte endoscópico (Figura 1B).
      NOTA: Identifique o trato reprodutivo, determinando o estado e a posição do infundíbulo e da ampola antes do TE para facilitar os próximos passos.
   10. Insira a agulha peridural 17-G na região inguinal entre 2-3 cm do infundíbulo (Figura 1B).
   11. Identifique a entrada do infundíbulo (Figura 2A, 2B).
   12. Insira o cateter carregado (passo 1.3) através da agulha peridural no abdômen (Figura 1C).
   13. Localize o oviduto e insira 1-2 cm do cateter peridural através do infundíbulo na ampola (Figura 2A-2C). Não progrida muito no oviduto para evitar danos e hemorragia.
   14. Solte os embriões no oviduto pressionando suavemente o êmbolo da seringa acoplada ao cateter (Figura 2D-2F). Ambas as bolhas de ar devem sair do cateter.
   15. Remova o cateter logo após a liberação dos embriões.
   16. Enxaguar o cateter, aspirar e libertar o meio manipulador para verificar a ausência dos embriões e confirmar a sua transferência com sucesso.
   17. Repita as etapas 1.4.11 a 1.4.16 no outro lado do útero, se desejar.
   18. Remova a agulha peridural e a câmera do endoscópio.
   19. Libere CO₂ através do trocarte endoscópico. Se o excesso de gás permanecer no abdômen do animal, ele sentirá dor e desconforto.
   20. Remova o trocarte endoscópico da cavidade abdominal. Remova a toalha cirúrgica.
   21. Interrompa a anestesia.
   22. Limpe a incisão feita pelo trocarte com solução de clorexidina. Feche a incisão feita pelo trocarte com um alumínio micronizado e um curativo plástico.

Resultados

Figura 1: Transferência laparoscópica de embriões assistida por laparoscopia (visão externa).A) Inserção do trocarte endoscópico (um portal). B) Inserção da câmera endoscópica e da agulha peridural (seta preta). C) Inserção do cateter de transferência de embriões (seta branca) através da agulha peridural.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino (BSA)	VWR	332
Cloridrato de buprenorfina	Alvet Escartí	Episódio 626	A encomendar por um veterinário licenciado.
Acetato de Buserelina	Sigma Aldrich	B3303
CO2	Air Liquide	Rolamento 99921	CO2 N48.
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773	Sem cloreto de cálcio
barbeador	Oster Dourado A5	Telefone: 078005-140-002
Câmera para endoscópio	Optomic Espanha S.A	OP-714
Trocarte de endoscópio com válvula de folheto de silicone	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	30114GK	Modelo de trocarte leve.
Sabonete de digluconato de clorexidina	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
Agulha epicranial 23G	Alvet Escartí	514056353	Agulhas menores também podem ser usadas.
Cateter peridural	Vygon corporativo	187,1
Agulha peridural	Vygon corporativo	187,1
Pomada para os olhos	Alvet Escartí	Rolamento 5273
Equipamento de laparoscopia	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	26003 AA	Laparoscópio Hopkins®, laparoscópio de visão reta de 0º-mm, comprimento de 30 cm, canal de trabalho de 5 mm.
luz	Optomic Espanha S.A	Fibrolux 250
Insuflador mecânico de CO2	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflator®
Tubo de silicone para insuflado	r Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
Estereomicroscópio	Leica	MZ16F	Existem opções mais baratas, como Leica MZ8 ou Nikon SMZ-10 ou SMZ-2B, para citar algumas.
Coelhos	Universitat Politècnica de València	Linha A	Outras linhas maternas, como Linha V ou Linha HP, podem ser usadas.