Coloração Oil Red O: Uma Técnica para Coloração de Lipídios Neutros em Hepatócitos para Detecção de Esteatose Hepática In Vitro

Resumo

Fonte: Campos-Espinosa, A. et al., Um Modelo de Esteatose Experimental In Vitro: Cultura de Células de Hepatócitos em Meio Condicionado por Sobrecarga Lipídica. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, demonstramos a coloração in vitro de lipídios neutros em hepatócitos para detectar esteatose hepática ou acúmulo excessivo de gordura no fígado. O excesso de gordura é acumulado nas células na forma de gotículas lipídicas. O óleo Red O é um corante lipossolúvel que se liga a lipídios neutros intracelulares nessas gotículas lipídicas. Quando observadas ao microscópio óptico, essas gotículas lipídicas intracelulares aparecem intensamente vermelhas.

Protocolo

1. Coloração lipídica com Oil-Red O

1. Coloque uma lamínula de cultura de células em cada poço em uma placa de 24 poços.
2. Semeie 100.000 células HepG2 por poço. Adicione 1 mL de RPMI 1640 padrão.
3. Pré-incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
4. Altere o meio RPMI 1640 padrão para o meio esteatogênico.
5. Incubar por 24 h, 2 dias, 3 dias e 4 dias, refrescando o meio esteatogênico a cada 24 h.
6. Após o tempo apropriado, descarte o sobrenadante.
7. Lave com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Descarte o sobrenadante.
8. Fixe com 1 mL de paraformaldeído a 4% em PBS.
9. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
10. Descarte o excesso de paraformaldeído.
11. Enxágue as células com 1 mL de água destilada.
12. Adicione 1 mL de isopropanol a 70% e incube por 5 min.
13. Descarte o excesso de isopropanol. Uma lavagem PBS não é necessária neste momento.
14. Adicione 1 mL de solução de óleo vermelho O e incube por 30 min.
15. Descarte o excesso da solução de O vermelho-óleo.
16. Enxágüe com 1 mL de água destilada.
17. Adicione 500 μL de solução de hematoxilina. Incubar por 3 min.
18. Descarte o excesso de solução de hematoxilina.
19. Enxágüe com 1 mL de água destilada.
20. Observe ao microscópio com uma ampliação de 400x (Objetiva 40x, Ocular 10x).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meios de cultura RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, EUA	Rolamento 31800-022	-
Soro fetal bovino (FBS)	ThermoFisher-Gibco, EUA	A4766801	-
Linhagem celular HepG2	ATCC, EUA	HB-8065	Células humanas de carcinoma hepatocelular.
Incubadora umidificada	Thermo Electronic Corporation, EUA	Modelo: 3110	Temperatura (37 °C ± 1 °C), umidade (90% ± 5%), CO2 (5% ± 1%)
Microscópio invertido Eclipse	NIKON, JPN	Modelo: TE2000-S	-
Isopropanol	Sigma-Aldrich, EUA	I9030-4L	-
Óleo Vermelho O Kit	Abcam, EUA	AB150678	Kit para visualização histológica da gordura neutra.
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich, EUA	Rolamento P6148-500G	-
Penicilina/estreptomicina	ThermoFisher-Gibco, EUA	15140-122	Antibióticos 10.000 U/mL Penicilina, 10.000 μg/mL de estreptomicina
Solução salina tamponada com fosfato	ThermoFisher-Gibco, EUA	10010-023	-
Pipetas sorológicas	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Não pirogênico, estéril, 5 mL
Pipetas sorológicas	Sarstedt, AUS	Nº 86.1254.001	Não pirogênico, estéril, 10 mL
bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich, EUA	S5761-1KG	Preparação de meios de cultura
Oleato de sódio	Santa Cruz Biotechnology, EUA	sc-215879A	-
Palmitato de sódio	Santa Cruz Biotechnology, EUA	SC-215881	-
Tripsina 0,05% / EDTA 0,53 mM	Corning, EUA	25-052-CL	-
Cluster de cultura de células de 24 poços	Corning, EUA	3524	Fundo plano com tampa. Cultura de tecidos tratada. Não pirogênico, poliestireno, estéril. 1/Pacote.