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1. Quantificação fluorométrica de lipídios neutros usando vermelho do Nilo
NOTA: Apenas 10 μl de uma suspensão de algas a 5 g/L são necessários para a leitura de fluorescência. Geralmente, o isolamento da biomassa de algas secas de 1,5 ml de caldo de cultura é mais do que suficiente. Além disso, a intensidade da luz da lâmpada no espectrofotômetro pode se degradar com o tempo. Recomenda-se incluir padrões em todos os experimentos para garantir que as variações no instrumento não adicionem erros desnecessários às medições.
- Preparar uma solução de vermelho do Nilo numa concentração de 10 μg/ml, dissolvida em etanol de grau álcool reagente. Conservar esta solução à escura a 4 °C.
- Preparar uma solução de etanol a 30% (v/v) em água desionizada e conservar a 4 °C.
- Preparar todas as amostras de algas com a mesma concentração de biomassa (recomenda-se 5 g/l) e da mesma forma que os padrões utilizados na medição. Faça isso suspendendo amostras pré-secas na quantidade apropriada de tampão fosfato (0,6 g/L de fosfato de potássio dibásico, 1,4 g/L de fosfato de potássio monobásico) ou ajustando a concentração de uma cultura de algas em crescimento para 5 g/L com tampão fosfato após medir a turbidez.
NOTA: As medições realizadas em culturas de algas vivas geralmente apresentam erros maiores, dependendo da precisão da curva de calibração da turbidez. A ressuspensão de amostras secas pode exigir o uso de um homogeneizador para dispersar totalmente a biomassa.
- Para cada amostra, misture 80 μl da solução de etanol a 30%, 10 μl da solução de vermelho do Nilo e 10 μl de suspensão de algas em um único poço de uma placa de 96 poços. Para ter devidamente em conta a variabilidade da medição de fluorescência, realizar 5 réplicas de cada amostra.
- Execute uma curva de calibração de dois pontos com padrões para levar em conta as variações do dia-a-dia no instrumento e na preparação. Preparar os padrões para medição de fluorescência usando o mesmo procedimento das amostras.
NOTA: Geralmente, dois pontos são suficientes para a recalibração do instrumento, três pontos podem ser executados para verificar a linearidade.
- Realize as medições de fluorescência em um espectrofotômetro leitor de placas de vários poços. As seguintes condições produziram os resultados mais consistentes:
- Agite a 1.200 rpm, orbite 3 mm, por 30 segundos.
- Incubar a 40 °C durante 10 min.
- Agite a 1.200 rpm, orbite 3 mm, por 30 segundos.
- Registre fluorescência, excitação a 530 nm, emissão a 604 nm.
- Converta as medições de fluorescência em teor de óleo usando os resultados dos padrões internos.