Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de reagentes
- Isolamento e calcificação de VSMCs da aorta murina
- Solução de digestão aórtica:
- Prepare uma solução fresca (~ 3-5 ml por aorta colhida) com Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) contendo 175 U / ml de colagenase tipo 2 e 1,25 U / ml de elastase. Esterilize a solução com um sistema de filtragem acionado por vácuo de 0,22 μm e mantenha a solução congelada até o uso.
- Meios celulares:
- Suplemente 500 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina. Aqueça o meio a 37 °C antes de usar.
- Meios de calcificação:
- Meio de calcificação A (NaPhos; usado em linhagens celulares de camundongos):
- Suplemente 100-500 ml de DMEM (volume conforme necessário) com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de fosfato de sódio, 100 unidades/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina. Aqueça o meio a 37 °C antes de usar.
Ou
- Meio de calcificação B (βGP/Asc/DEX; usado em linhagens celulares de camundongos ou humanos):
- Suplemente 100-500 ml de DMEM (volume conforme necessário) com 10% de soro fetal bovino, 10 mM de β-glicerofosfato dissódico, 50 μg/ml de ácido L-ascórbico, 10 nM de dexametasona, 100 unidades/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina. Aqueça o meio a 37 °C antes de usar.
2. Dissecção do rato
- Eutanasiar camundongo com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de 200 mg/kg.
- Coloque o animal em decúbito dorsal na placa de dissecação e estabilize prendendo cada pata na placa. Usando um microscópio de dissecação e uma tesoura pequena, faça uma incisão na linha média que se estende do abdômen inferior ao tórax superior.
- Retire a pele com uma pinça e remova o peritônio, revelando os órgãos abdominais. Remova os órgãos gastrointestinais, tomando cuidado para não transeccionar a aorta.
- Faça uma incisão lateral no diafragma anterior e continue a incisão no abdômen. Usando uma tesoura de dissecação, solte a caixa torácica cortando as laterais das costelas e removendo o tecido mole aderente à porção superior do esterno. Remova a caixa torácica, revelando os pulmões.
- Deixe o coração no lugar inicialmente (para ajudar a identificar e dissecar a aorta proximal) e remova cuidadosamente os pulmões. Remova o timo, a traqueia e o esôfago com cuidado, garantindo que a aorta permaneça intacta.
- Com pinça reta fina e tesoura de microdissecação, remova o tecido mole ao redor da aorta da bifurcação ilíaca para o arco aórtico, prestando muita atenção ao remover a gordura peri-aórtica (Figura 1A). Remover a gordura e o tecido mole remanescentes ao redor dos grandes ramos do arco aórtico (ou seja, artérias braquiocefálica, carótida comum e subclávia, Figura 1B).
nota: É importante remover a gordura da aorta porque a gordura pode aumentar o sinal de fundo ao realizar imagens de fluorescência.
- Remova o coração da cavidade torácica, destacando-o cuidadosamente da aorta proximal e descarte. Transeccione a aorta distal na bifurcação ilíaca. Usando uma agulha de insulina, injete solução salina normal na aorta a partir do arco aórtico para lavar as células sanguíneas restantes. Descole a aorta junto com os vasos do arco aórtico, removendo-a completamente do corpo.
- Coloque a aorta em solução salina normal no gelo até que esteja pronta para a imagem.
3. Isolamento de células musculares lisas vasculares da aorta murina primária
- Coloque as aortas em HBSS frio até que as dissecções estejam completas. Corte cuidadosamente qualquer gordura periaórtica e tecido mole restante, deixando apenas a aorta.
- Sob uma capa de cultura de tecidos estéril, transfira as aortas para a solução de digestão aórtica em placas de cultura de tecidos de 35 mm x 10 mm. Colocar numa incubadora a 37 °C durante 30 min com um balanço suave e intermitente. Após a digestão, as aortas exibem uma aparência esticada ou desgastada.
- Com o microscópio de dissecção e a pinça estéril, remova a camada adventícia externa da aorta, mantendo a camada medial intacta. Uma técnica para remover a adventícia é descascar a camada externa da aorta em uma extremidade e removê-la da camada medial subjacente como uma meia pode ser removida
.
- Uma vez removida a camada adventícia, colocar a aorta restante numa nova placa de cultura de tecidos com meios de cultura de células e conservar a 37 °C com 5% de CO2 durante 2-4 horas.
- Sob um capuz estéril e usando uma tesoura de microdissecção estéril de 3 mm, corte a aorta em anéis de 1-2 mm de largura.
- Coloque esses anéis em uma nova placa de cultura de tecidos com solução de digestão aórtica e incube a 37 ° C com um balanço intermitente suave por 120 min. Pipete a solução para cima e para baixo várias vezes durante esta incubação para ressuspender as células.
- Adicionar 5 ml de meios de cultura de células quentes à solução de digestão e transferir para um tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugue o tubo por 5 min a 200 x g.
- Aspire o meio e ressuspenda as células no volume desejado de meio de cultura celular (por exemplo, 5 ml).
- Colocar em placas toda a quantidade de células isoladas de cada aorta num balão de cultura de células de 25 cm2 e incubar a 37 °C com CO2 a 5%. Propague células usando técnicas padrão, conforme descrito anteriormente. Durante os primeiros 7 a 10 dias de incubação, troque o meio a cada 72 a 96 horas. À medida que as células se aproximam da confluência, reabasteça o meio com mais frequência (a cada 48 horas).
nota: Pode levar muitas semanas para cultivar uma quantidade suficiente de células.
- Uma vez confluentes, passam as células com tripsina que é aquecida a 37 °C.
- Adicione 0,5-1,0 ml de tripsina a cada frasco de cultura e incube por 3-5 min; bata suavemente na lateral do frasco a cada 30-60 segundos, conforme necessário, para separar as células da superfície.
- Assim que as células se separarem do fundo do frasco, adicionar 10 ml de meio celular às células em tripsina. Centrifugue as células a 200 x g por 5 min. Aspirar o meio e a tripsina do sedimento celular. Ressuspenda as células na quantidade desejada de meio celular fresco (por exemplo, 5-10 ml) e transfira para um novo frasco (com algumas células transferidas para uma lâmina de câmara).
- Na primeira passagem das células, confirme a linhagem de células musculares lisas com técnicas imunocitoquímicas padrão, conforme descrito anteriormente, usando um anticorpo direcionado contra a actina α-de músculo liso.
4. Induzindo a calcificação de células musculares lisas cultivadas
- Células de placa obtidas de 3.12 em um formato de 6 poços.
nota: Recomenda-se começar com 1 x 105 células/poço em um volume total de 2,0 ml de meio celular por poço.
- Permite que as células cresçam em meio de calcificação A ou B por pelo menos 7 dias em um formato de placa de 6 poços. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2.
- Troque a mídia celular a cada 48 horas.
5. Avaliando a calcificação VSMC usando o método de coloração de von Kossa
NOTA: O método de von Kossa para medir a calcificação da matriz extracelular de tecidos ou células cultivadas é baseado na substituição de íons de cálcio ligados a fosfato por íons de prata. Na presença de compostos leves e orgânicos, os íons de prata são reduzidos e visualizados como prata metálica. Qualquer prata não reagida é removida por tratamento com tiossulfato de sódio. O protocolo para coloração de von Kossa é o seguinte:
- Aspirar os meios das placas de cultura de células.
- Fixe as células colocando-as em 1 ml de formalina a 10% em temperatura ambiente por 20 min.
- Retire a formalina e lave as células fixas com água destilada por 5 min.
- Incube as células em 1 ml de solução de nitrato de prata a 5% sob um bulbo de 60-100 W por 1-2 horas.
- Aspirar a solução de nitrato de prata e lavar com água destilada durante 5 min.
- Remova a prata que não reagiu colocando as células em 1 ml de solução de tiossulfato de sódio a 5% (p / v) em água destilada por 5 min.
- Enxágue as células com água destilada por 5 min. Repita as lavagens 3x. A coloração de von Kossa está pronta para aquisição de imagens com microscopia de luz invertida padrão.
- Etapa opcional: Contra-coloração com 1ml de vermelho nuclear rápido por 5 min. Siga com três lavagens com água destilada (5 min cada).
