Coloração de Von Kossa de células musculares lisas vasculares da aorta: uma técnica in vitro para avaliação da calcificação da camada medial arterial

Resumo

Fonte: O'Rourke, C., et al. Calcificação de células musculares lisas vasculares e imagens de calcificação e inflamação da aorta. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra uma técnica de coloração para avaliar a calcificação arterial medial das células musculares lisas vasculares in vitro. O método von Kossa emprega uma reação fotoquímica para depositar prata metálica nos locais de calcificação e conferir uma coloração preta.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de reagentes

1. Isolamento e calcificação de VSMCs da aorta murina
   1. Solução de digestão aórtica:
      1. Prepare uma solução fresca (~ 3-5 ml por aorta colhida) com Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) contendo 175 U / ml de colagenase tipo 2 e 1,25 U / ml de elastase. Esterilize a solução com um sistema de filtragem acionado por vácuo de 0,22 μm e mantenha a solução congelada até o uso.

Resultados

Figura 1: Dissecção representativa de uma aorta de um camundongo do tipo selvagem. (A) Uma imagem da aorta torácica e abdominal estendendo-se até a bifurcação da artéria ilíaca comum é representada após a remoção dos órgãos sobrejacentes e da gordura peri-aórtica. (B) Uma visão focada do arco aórtico com as artérias braquiocefálica, carótida comum esquerda e subclávia esquerda. Barras de escala = 1 .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo cônico de 15 ml	falcão	352096
Anticorpo de actina de músculo liso alfa	sigma	SAB2500963
Corrediça da câmara	Nunc Lab-Tek	154461
Colagenase Tipo 2	Worthington	LS004176
dexametasona	sigma	D4902
Meio Eagle Modificado de Dulbecco	Tecnologias da Vida	11965-084
Elastásio	sigma	E1250
Soro fetal bovino	Gibco	16000-044
Fórceps, ponta fina	Roboz	RS-4972
Fórceps serrilhado de curva completa	Roboz	RS-5138
Formol (10%)	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 15740
Solução salina balanceada de Hank	Gibco	14025-092
Seringa de insulina com agulha	Terumo	SS30M2913
Ácido L-ascórbico	sigma	A-7506
Tesoura de mola de microdissecação (13 mm)	Roboz	RS-5676
Tesoura de mola de microdissecação (3 mm)	Roboz	RS-5610
Solução salina normal	Hospira	Telefone: 0409-4888-10
Vermelho rápido nuclear	Sigma-Aldrich	N3020
Penicilina/estreptomicina	Corning	30-001-CI
Nitrato de prata (5%)	Companhia Química Ricca	Nº 6828-16
Fosfato de sódio dibásico heptahidratado	Sigma-Aldrich	S-9390
Tiossulfato de sódio	sigma	S-1648
ß-glicerofosfato sal dissódico hidratado	sigma	G9422
Balão de cultura de tecidos, 25 cm2	falcão	353108
Placa de cultura de tecidos (35 mm x 10 mm)	falcão	353001
Placa de cultura de tecidos, seis poços	falcão	353046
tripsina	Corning	25-053-CI
Sistema de filtragem acionado por vácuo	Millipore	SCGP00525