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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Protocolo de coloração de eosina
- Para fixar amostras de tecidos moles, encher um tubo de centrífuga de 50 mL com uma solução fixadora contendo 9,5 mL de solução de formaldeído (FA) a 4% (v/v) e 0,5 mL de ácido acético glacial (AA).
nota: Prepare a solução de AG a partir de uma solução de AG isenta de ácido a 37% estabilizada com aproximadamente 10% de metanol. Dilua ainda mais a solução de FA com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Escolha a SPB sem cálcio e magnésio. Manter a solução diluída de AG por um período não superior a um mês. Durante a acidificação, o pH da solução fixadora muda de neutro para aproximadamente 3,
cuidado: Como a AF é tóxica aguda para órgãos, corrosiva e cancerígena, o uso de um exaustor é obrigatório e deve ser usado equipamento individual de proteção adequado.
- Adicione a amostra de tecido mole recém-removida a um tubo de centrífuga de 50 mL e leve à geladeira o tubo de centrífuga de 50 mL por 24-72h.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
- Lave a amostra de tecido mole com solução de DPBS por 1h.
- Para corar a amostra de tecido mole fixada (por exemplo, um rim de camundongo inteiro), coloque o tecido mole em 2 mL de solução de coloração Y de eosina e incube a amostra por 24 h. Mantenha a amostra em uma placa de agitação horizontal para um balanço suave (cerca de 60 rpm) durante o processo de incubação.
nota: A solução de coloração Y de eosina tem uma concentração de 30% (p / v) em água destilada. Escolha o volume da solução de coloração de forma que a amostra seja completamente coberta pela solução de coloração e deixe a amostra se mover livremente dentro do recipiente de amostra. O tempo de incubação pode diferir para outras amostras e deve ser ajustado em conformidade.
- Após a coloração, remova a amostra de tecido mole cuidadosamente do recipiente de amostra.
- Remova cuidadosamente o excesso de agente de coloração com papel de seda de celulose.
- Coloque a amostra de tecido mole em um recipiente de amostra cônico acima de uma fase de vapor de etanol para armazenamento e uso posterior.
nota: O recipiente de amostra cônico deve sempre conter algumas gotas de etanol a 70% (v/v) na parte inferior do tubo para manter a amostra de tecido mole úmida e evitar artefatos.