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1. Preparação de soluções de coloração
- Filtre a solução estoque de hematoxilina Harris para remover quaisquer sólidos que tenham precipitado.
- Dobre um filtro de café ao meio para que o filtro crie um cone. Abra o painel lateral para que o líquido passe pelo filtro, permitindo que quaisquer detritos sejam capturados.
- Coloque o filtro dentro de um funil e o funil em uma garrafa de mídia de vidro. Despeje gradualmente a hematoxilina de estoque através do filtro.
cuidado: A hematoxilina é perigosa em caso de contato com os olhos, ingestão e inalação. Sempre use jaleco e luvas e manuseie a solução de estoque com um capuz químico.
- Prepare 0,05% de HCl adicionando 125 μL de 12 N HCl a 250 mL de ddH2O.
- Prepare a mistura de solução de eosina Y-floxina B combinando 25 mL de eosina Y a 1% (aq), 2,5 mL de floxina B a 1% (aq), 195 mL de etanol a 95% e 1 mL de ácido acético glacial em um frasco de vidro. Misture bem girando e guarde na RT
cuidado: A eosina Y é perigosa no caso de contato com os olhos, ingestão e inalação. Sempre use jaleco e luvas e manuseie a solução de estoque com um capuz químico.
- Prepare etanol a 2% adicionando 2 mL de álcool etílico puro a 98 mL de água de ovo.
cuidado: O álcool etílico é irritante para os olhos. Sempre use equipamento de proteção adequado ao manusear álcool etílico. Também é inflamável e deve ser manuseado e armazenado de acordo.
NOTA: Prepare etanol fresco a 2% de cada vez antes de realizar o tratamento agudo com etanol.
2. Coloração de hematoxilina e eosina de cortes de parafina
- Desparafinize as lâminas mergulhando-as em xileno 100% por 15 min; troque-as por xileno 100% fresco por mais 15 min.
- Reidrate as lâminas mergulhando-as na seguinte série de etanol graduado até que o líquido escorra limpo das lâminas. Para cada solução, mergulhe de 8 a 10 vezes, 2 s por mergulho: 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol, 30% etanol e água deionizada.
nota: O protocolo pode ser interrompido aqui e os slides podem ser deixados em RT na água por várias horas. Se necessário, as lâminas podem ser armazenadas a 4 °C em água O/N.
- Coloque as lâminas em hematoxilina Harris 100% filtrada por 4 min. Transfira-as imediatamente de volta para o recipiente com água deionizada. Passe água deionizada no canto traseiro do recipiente mais distante das seções. Esvazie o recipiente periodicamente até que a água não fique mais roxa.
nota: Não deixe a água correr diretamente para os escorregadores, pois as seções podem sair dos escorregadores.
- Verifique rapidamente a intensidade da hematoxilina em um microscópio de dissecação usando luzes pescoço de ganso; não deixe as lâminas secarem. Se a mancha atingiu a intensidade desejada, continue para a próxima etapa. Se a cor não estiver escura o suficiente, coloque as lâminas em hematoxilina 100% por 1 min e repita as lavagens com água antes de verificar novamente.
nota: A hematoxilina precisa ser escura o suficiente para que a cor não seja perdida durante a coloração com eosina. No entanto, se a coloração de hematoxilina for observada no citoplasma, as seções serão supermarcadas.
- Mergulhe as lâminas duas vezes em HCl 0,05% e transfira-as imediatamente de volta para o recipiente com água deionizada limpa. Esvazie a água e encha novamente o recipiente com água duas vezes.
- Transfira as lâminas para etanol a 95% por 30 s e, em seguida, transfira-as para um novo recipiente com etanol a 95% por 30 s.
- Coloque as lâminas na solução de eosina Y-Phloxine B por 2 min. Transfira as lâminas de volta para o recipiente anterior de etanol a 95% e verifique rapidamente a intensidade da cor sob o microscópio de dissecação. Se a coloração for suficiente, prossiga para a próxima etapa. Caso contrário, retorne à solução de eosina por 30 s, verifique novamente e repita conforme necessário.
nota: A coloração de eosina suficiente é rosa brilhante e aparece em contraste distinto com a coloração de hematoxilina. Certifique-se de limpar qualquer solução da parte de trás das lâminas ao verificar ao microscópio para que nenhuma cor falsa seja observada. Como a eosina é composta de etanol a 95%, períodos prolongados de tempo em etanol a 95% durante a verificação da intensidade da cor podem liberar um pouco da cor.
- Transfira as lâminas para 100% de isopropanol por 15 s. Substitua por 100% de isopropanol novo e coloque as lâminas de volta no isopropanol por mais 15 s. Repita este processo para um total de 6 lavagens de isopropanol.
cuidado: O isopropanol é um irritante ocular e respiratório. Certifique-se sempre de usar equipamento de proteção adequado e evitar respingos. Também é altamente inflamável e deve ser armazenado e manuseado de acordo.
nota: Para economizar em reagentes, descarte apenas a primeira lavagem de isopropanol (rosa). Mantenha as outras cinco soluções de lavagem em frascos numerados de 1 a 5, para serem reutilizadas na próxima coloração. Ao reutilizar lavagens, comece com o frasco numerado "1" e descarte após o uso. Depois de usar a lavagem "2", despeje-a na garrafa "1" e assim por diante. A lavagem final deve ser sempre isopropanol fresco.
- Coloque as lâminas em xilenos 100% por 3 min. Remova uma lâmina de cada vez e coloque uma lamínula.
- Adicione meio de montagem suficiente para cobrir as seções e mergulhe-as em 100% xileno.
nota: Esta etapa suavizará a superfície do meio de montagem e removerá quaisquer bolhas.
- Aplique uma lamínula na parte inferior do slide.
nota: O meio de montagem deve puxar o slide para a posição. Se a lamínula não estiver reta ou completamente assentada, bata suavemente no lugar.
- Seque qualquer excesso de meio de montagem em uma toalha de papel até que apenas uma linha fina seja vista. Mergulhe um lenço de papel no xileno e limpe a parte de trás da lâmina para remover qualquer meio que tenha pingado. Coloque o slide em uma superfície resistente, mas móvel, como um pedaço de papelão. Aplique uma lamínula em todos os slides restantes da mesma maneira. Deixe o xileno evaporar no exaustor por 10 min.
nota: Quaisquer materiais contaminados com xileno devem ser removidos e descartados em um recipiente lacrado no capô para evitar que quaisquer vapores escapem.
- Deixe o meio de montagem endurecer em RT O/N.
3. Imagem e armazenamento de lâminas coradas
- Seções de imagem em um microscópio invertido composto.
nota: As lâminas podem ser mantidas em temperatura ambiente indefinidamente.