Coloração com azul de metileno para avaliar a formação de colônias metastáticas in vitro: um procedimento de coloração para avaliar a metástase quantificando células cancerígenas colhidas do modelo de camundongo cancerígeno

Resumo

Fonte: Nagai-Singer, M. A., et al. Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação de metástases pulmonares no modelo de câncer de mama 4T1. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, descrevemos o procedimento de coloração com azul de metileno para quantificar a carga metastática contando colônias coradas obtidas pela cultura de células cancerígenas colhidas de órgãos distantes de um modelo de camundongo após a injeção.

Protocolo

Todos os procedimentos de modelo animal foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Processando tecidos

NOTA: Todas as etapas desta seção devem ser feitas usando a técnica estéril.

1. Rotule 1 tubo cônico de 15 mL por camundongo e adicione 2,5 mL de mistura de colagenase tipo IV e 30 unidades de elastase a cada tubo. Para fazer a mistura de colagenase tipo IV, dissolva 2 mg de colagenase tipo IV por mL 1x HBSS e filtro estéril. Isso pode ser armazenado por até 12 meses a -20 °C e descongelado quando necessário.
2. Transfira o pulmão de camundongo colhido para o segundo, limpe 1x HBSS bem para essa amostra. Agite usando uma pinça para remover qualquer sangue restante. Transfira o pulmão limpo para uma placa vazia de cultura de tecidos de 3,5 cm. Pique o pulmão com uma tesoura. Placa de enxágue com 2,5 mL de 1x HBSS, transfira 1x HBSS e pedaços de pulmão para um tubo cônico de 15 mL já contendo coquetel de colagenase/elastase (5 mL no total).
3. Incubar durante 75 minutos a 4 °C. Continuar a misturar as amostras durante este tempo, por isso coloca os tubos num balancim ou numa roda rotativa. Durante esta etapa de incubação, rotule tubos de centrífuga de 50 mL e placas de cultura de tecidos de 10 cm para cada camundongo. Se estiver fazendo uma diluição, rotule placas de cultura de tecidos de 10 cm suficientes para as diluições.
   nota: Rotule a tampa das placas de cultura de tecidos. Se rotular a própria placa, a escrita interferirá na análise de Fiji-ImageJ.
4. Aumente o volume de cada tubo para um total de 10 mL com 1x HBSS. Despeje o conteúdo sobre um filtro de células de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL para cada amostra. Use o êmbolo de uma seringa de 1 mL para moer suavemente a amostra através do filtro para permitir que mais células sejam filtradas.
5. Centrifugue por 5 minutos a 350 x g em temperatura ambiente (RT). Descarte o sobrenadante e lave o pellet com 10 mL de 1x HBSS. Repita esta etapa duas vezes.
6. Ressuspenda o pellet em 10 mL de meio de cultura completo 60 μM 6TG, RPMI ou IMDM. Amostras em placas de cultura de células de 10 cm, utilizando um esquema de diluição, se desejado. Incubar a 37 °C, 5% CO₂ por 5 dias.
   NOTA: 1:2, 1:10 e 1:100 são diluições comuns que precisarão ser determinadas empiricamente com base nos parâmetros do estudo.
   CUIDADO: 6TG é tóxico. Tenha cuidado ao manusear e siga todas as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental para descarte.

2. Placas de coloração

1. Despeje o meio de cultura das placas no recipiente de lixo apropriado. Fixe as células adicionando 5 mL de metanol não diluído por placa e incube por 5 minutos em RT, certificando-se de agitar o metanol para que cubra toda a placa.
   cuidado: O metanol é perigoso se ingerido, inalado ou na pele. Use uma hotte para esta etapa.
2. Despeje o metanol das placas no recipiente de lixo apropriado. Enxágue as placas com 5 mL de água destilada por placa e despeje a água no recipiente de lixo apropriado. Adicione 5 mL de azul de metileno a 0,03% por placa e incube por 5 minutos em RT, certificando-se de girar a solução de azul de metileno para cobrir toda a placa.
3. Despeje o azul de metileno no recipiente de lixo apropriado. Enxágue as placas novamente com 5 mL de água destilada por placa. Vire os pratos de cabeça para baixo e seque contra uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Coloque o prato na tampa e deixe secar ao ar durante a noite em RT.
   nota: As colônias metastáticas serão azuis. Depois que as placas estiverem secas, elas podem ser armazenadas no RT indefinidamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
metanol	Fisher Científico	A412SK-4
Azul de metileno	Sigma-Aldrich	03978-250ML
RMPI-1640 Médio	ATCC	30-2001
Balancim ou roda giratória	qualquer	qualquer
Filtro descartável estéril com membrana PES	ThermoFisher Scientific	Rolamento 568-0010
Colagenase tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138
Placas de cultura de tecidos de 3,5 cm	Nunclon	153066
Placas de cultura de tecidos de 10 cm	Fisher Científico	08-772-22
Tubo de centrífuga de 15 mL	Fisher Científico	14-959-70C
1X Solução Salina Balanceada de Hank (HBSS)	Thermo Científico	SH3026802
Tubo de centrífuga de 50 mL	Fisher Científico	14-959-49A
Filtro de células de 70 μM	Fisher Científico	22-363-548
70% de etanol	Sigma Aldrich	E7023	Diluir a 70% com água DI
incubadora			Precisa ser capaz de 5% de CO2 e 37 °C
fórceps	Roboz	RS-8100
centrifuga	qualquer	qualquer	Precisa ser capaz de 125 x g e 300 x g
água destilada	qualquer	qualquer
Elastásio	MP Biomédicos	100617