Coloração com ácido periódico de Schiff de células: uma técnica in vitro para detectar níveis de glicogênio em células mononucleares do sangue periférico

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Isolamento PBMC de sangue total

NOTA: Realize este procedimento em um gabinete de biossegurança usando técnica estéril e equipamento esterilizado pelo fabricante.

1. Despeje cuidadosamente 10-15 ml de sangue total dos tubos de coleta de sangue heparinizado (anticoagulante) em um tubo cônico estéril de 50 ml. Para pequenos derramamentos de sangue, limpe com ddH₂O e 70% de EtOH usando um lenço de limpeza.
2. Dilua o sangue no tubo cônico na proporção de 1:1 com tampão fosfato salino (PBS 1x) pH 7,4. Assegurar que o volume total máximo não excede 30 ml.
3. Misture delicadamente usando uma pipeta sorológica evitando bolhas.
   nota: NÃO misture invertendo o tubo para evitar acúmulo de sangue na tampa e subsequente infiltração durante a centrifugação.
4. Adicionar 13 ml de Ficoll-paque (ver tabela de materiais) a um novo tubo cónico de 50 ml de capacidade. Mantenha o tubo na posição vertical no rack.
5. Usando uma pipeta de transferência, pegue sangue diluído, toque a ponta da pipeta de transferência na parede interna do tubo perto do topo. Com pressão lenta e constante, transfira o sangue ao longo da parede interna do tubo, formando uma camada de sangue no topo da camada de sacarose. Faça esta etapa várias vezes até que todo o sangue tenha sido transferido.
6. Tampe bem o tubo e centrifugue o tubo à temperatura ambiente por 30 min a 700 x g em um rotor oscilante com aceleração média definida como 5 e desaceleração definida como ZERO.
7. Retire lentamente o tubo e, sem perturbar as camadas, leve-o de volta ao gabinete de biossegurança.
8. Recolha cuidadosamente o revestimento leucocitário (fina camada branca turva), onde se encontram os PBMC, colocados entre as camadas de PBS/plasma e ficoll utilizando uma pipeta de transferência. Evite coletar a camada de sacarose e não perturbe a camada de glóbulos vermelhos.
9. Transfira o revestimento buffy para um novo tubo cônico estéril de 50 ml. Pode levar várias vezes a repetição da etapa 1.8 para coletar todo o PBMC.
10. Adicionar PBS pH 7,4 ao tubo com o PBMC e encher até à marca de 45 ml. Agite bem o tubo. Não vórtice.
11. Lavagem 1: Centrifugue por 15 min a 480 x g com aceleração e desaceleração máximas definidas para 9. Observe a formação de um pellet de PBMCs no fundo do tubo cônico.
12. Rejeitar o PBS (sobrenadante) para um copo de plástico com 10 ml de lixívia.
13. Afrouxe o pellet celular "empilhando" suavemente contra uma superfície ondulada (ou seja, rack vazio). Não vórtice.
14. Adicione 25 ml de PBS fresco pH 7,4 ao tubo. Se mais de um tubo estiver sendo processado, agrupe os pellets nesta etapa.
15. Lavagem 2: Centrifugue o tubo por 12 min a 480 x g com aceleração e desaceleração máximas definidas para 9.
16. Descarte o PBS (sobrenadante) no copo de plástico com um pouco de alvejante.
17. Suavemente "rack" contra uma superfície ondulada (ou seja, rack vazio). Não vórtice.
18. Adicione 25 ml de PBS fresco ao tubo.
    1. Retire 50 μl das células e transfira para um tubo de microcentrífuga para contagem de viabilidade.
    2. Adicione uma quantidade igual (50 μl) de azul de tripano (uma mancha de viabilidade) e pipete para cima e para baixo para misturar suavemente.
19. Retirar 10 μl e transferi-los para um hemocitómetro para verificar a viabilidade das células por ml. Registar o número de células/ml.
20. Retire a quantidade desejada de células e centrifugue o tubo por 12 min a 480 x g com aceleração e desaceleração máximas definidas para 9.
21. Descarte o PBS (sobrenadante) no béquer com água sanitária.
22. Suavemente "rack" contra uma superfície ondulada (ou seja, rack vazio). Adicione 80 μl de PBS ao tubo.

2. Fazendo o slide PBMC

1. Coloque 80 μl das células em uma lâmina de microscópio. Esfregue a gota com a ajuda de outra lâmina ou coloque 2 gotas de 40 μl cada em ambas as extremidades da lâmina.
2. Deixe a corrediça no armário de segurança biológica para secar. Rotule o slide com um lápis no lado fosco.

3. Corrigindo as amostras nos slides

1. Prepare a solução fixadora misturando 0,5 ml de formaldeído a 37% com 4,5 ml de etanol a 99%.
2. Depois que as lâminas estiverem secas, retire 2 ml da solução fixadora recém-feita e despeje-a na lâmina de forma que toda a superfície da lâmina fique coberta.
3. Deixe a solução na lâmina por 1 min. Enxágue a lâmina por 1 min com água da torneira e deixe-a secar ao ar.

4. Fazendo a solução de amilase para controle negativo

1. Pegue 0,25 g de amilase em pó e dissolva em 50 ml de água destilada. Deitar a solução num copo limpo de 100 ml.
2. Mergulhe a lâmina no béquer de modo que metade da lâmina receba o tratamento e a outra metade permaneça sem tratamento e, em seguida, incube por 15 min à temperatura ambiente (Figura 1C).
3. Anote de que lado da lâmina está recebendo o tratamento com amilase. Desenhe uma linha na parte de trás da lâmina indicando a fronteira entre o tratamento e o controle.
4. Lave as lâminas com ddH₂O para remover a solução de amilase e deixe a lâmina secar ao ar.

5. Realize coloração e imagem de Schiff com ácido periódico (PAS)

NOTA: Os reagentes PAS são tóxicos por inalação e corrosivos, portanto, as etapas precisam ser executadas em uma capela de exaustão química e os resíduos devem ser descartados adequadamente de acordo com as diretrizes institucionais.

1. Coloque a lâmina em uma superfície plana e despeje 1,50-2,00 ml de solução de ácido periódico na amostra. Incube por 5 min em temperatura ambiente.
2. Enxágue as lâminas em várias cargas de água destilada.
3. Despeje 1,50-2,00 ml de reagente de Schiff na lâmina e incube-o em temperatura ambiente por 15 min.
4. Lave a lâmina com água destilada por 5 min e deixe secar ao ar.
5. Aplique 10 μl de mídia de montagem na lâmina e cubra com duas lamínulas pequenas ou aplique 50 μl e use uma lamínula grande.
6. Aplique esmalte transparente nas bordas da lamínula, deixe secar durante a noite.

6. Obtenha imagens com o microscópio de luz binocular usando a objetiva 100X

Figura 1: Metodologia passo a passo da coloração PAS em PBMC.(A) Primeiro, o isolamento do PBMC é obtido através do gradiente de ficoll, o painel esquerdo mostra a preparação antes da centrifugação, o painel direito mostra após a centrifugação, onde a camada leucocitária contendo o PBMC é observada no centro do tubo. (B) PBMCs isolados são fixados na lâmina usando solução fixadora de formalina-etanol. A lâmina é enxaguada suavemente com água destilada de um frasco de plástico. (C) A lâmina é então colocada em um copo de 100 ml cheio até a metade com solução de amilase, que dissolverá o glicogênio. A lâmina é enxaguada suavemente. (D) A lâmina é tratada com solução ácida periódica, onde ocorre a oxidação dos sacarídeos. As lâminas são enxaguadas suavemente; Isso removerá o excesso de ácido periódico e interromperá a etapa de oxidação. (E) Quando o reagente de Schiff é adicionado às lâminas, ele reage com os aldeídos criados durante a etapa de oxidação. Este reagente incolor resultará em um produto magenta vermelho escuro. As lâminas são enxaguadas suavemente para remover o excesso de reagente de Schiff.