Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento PBMC de sangue total
NOTA: Realize este procedimento em um gabinete de biossegurança usando técnica estéril e equipamento esterilizado pelo fabricante.
- Despeje cuidadosamente 10-15 ml de sangue total dos tubos de coleta de sangue heparinizado (anticoagulante) em um tubo cônico estéril de 50 ml. Para pequenos derramamentos de sangue, limpe com ddH2O e 70% de EtOH usando um lenço de limpeza.
- Dilua o sangue no tubo cônico na proporção de 1:1 com tampão fosfato salino (PBS 1x) pH 7,4. Assegurar que o volume total máximo não excede 30 ml.
- Misture delicadamente usando uma pipeta sorológica evitando bolhas.
nota: NÃO misture invertendo o tubo para evitar acúmulo de sangue na tampa e subsequente infiltração durante a centrifugação.
- Adicionar 13 ml de Ficoll-paque (ver tabela de materiais) a um novo tubo cónico de 50 ml de capacidade. Mantenha o tubo na posição vertical no rack.
- Usando uma pipeta de transferência, pegue sangue diluído, toque a ponta da pipeta de transferência na parede interna do tubo perto do topo. Com pressão lenta e constante, transfira o sangue ao longo da parede interna do tubo, formando uma camada de sangue no topo da camada de sacarose. Faça esta etapa várias vezes até que todo o sangue tenha sido transferido.
- Tampe bem o tubo e centrifugue o tubo à temperatura ambiente por 30 min a 700 x g em um rotor oscilante com aceleração média definida como 5 e desaceleração definida como ZERO.
- Retire lentamente o tubo e, sem perturbar as camadas, leve-o de volta ao gabinete de biossegurança.
- Recolha cuidadosamente o revestimento leucocitário (fina camada branca turva), onde se encontram os PBMC, colocados entre as camadas de PBS/plasma e ficoll utilizando uma pipeta de transferência. Evite coletar a camada de sacarose e não perturbe a camada de glóbulos vermelhos.
- Transfira o revestimento buffy para um novo tubo cônico estéril de 50 ml. Pode levar várias vezes a repetição da etapa 1.8 para coletar todo o PBMC.
- Adicionar PBS pH 7,4 ao tubo com o PBMC e encher até à marca de 45 ml. Agite bem o tubo. Não vórtice.
- Lavagem 1: Centrifugue por 15 min a 480 x g com aceleração e desaceleração máximas definidas para 9. Observe a formação de um pellet de PBMCs no fundo do tubo cônico.
- Rejeitar o PBS (sobrenadante) para um copo de plástico com 10 ml de lixívia.
- Afrouxe o pellet celular "empilhando" suavemente contra uma superfície ondulada (ou seja, rack vazio). Não vórtice.
- Adicione 25 ml de PBS fresco pH 7,4 ao tubo. Se mais de um tubo estiver sendo processado, agrupe os pellets nesta etapa.
- Lavagem 2: Centrifugue o tubo por 12 min a 480 x g com aceleração e desaceleração máximas definidas para 9.
- Descarte o PBS (sobrenadante) no copo de plástico com um pouco de alvejante.
- Suavemente "rack" contra uma superfície ondulada (ou seja, rack vazio). Não vórtice.
- Adicione 25 ml de PBS fresco ao tubo.
- Retire 50 μl das células e transfira para um tubo de microcentrífuga para contagem de viabilidade.
- Adicione uma quantidade igual (50 μl) de azul de tripano (uma mancha de viabilidade) e pipete para cima e para baixo para misturar suavemente.
- Retirar 10 μl e transferi-los para um hemocitómetro para verificar a viabilidade das células por ml. Registar o número de células/ml.
- Retire a quantidade desejada de células e centrifugue o tubo por 12 min a 480 x g com aceleração e desaceleração máximas definidas para 9.
- Descarte o PBS (sobrenadante) no béquer com água sanitária.
- Suavemente "rack" contra uma superfície ondulada (ou seja, rack vazio). Adicione 80 μl de PBS ao tubo.
2. Fazendo o slide PBMC
- Coloque 80 μl das células em uma lâmina de microscópio. Esfregue a gota com a ajuda de outra lâmina ou coloque 2 gotas de 40 μl cada em ambas as extremidades da lâmina.
- Deixe a corrediça no armário de segurança biológica para secar. Rotule o slide com um lápis no lado fosco.
3. Corrigindo as amostras nos slides
- Prepare a solução fixadora misturando 0,5 ml de formaldeído a 37% com 4,5 ml de etanol a 99%.
- Depois que as lâminas estiverem secas, retire 2 ml da solução fixadora recém-feita e despeje-a na lâmina de forma que toda a superfície da lâmina fique coberta.
- Deixe a solução na lâmina por 1 min. Enxágue a lâmina por 1 min com água da torneira e deixe-a secar ao ar.
4. Fazendo a solução de amilase para controle negativo
- Pegue 0,25 g de amilase em pó e dissolva em 50 ml de água destilada. Deitar a solução num copo limpo de 100 ml.
- Mergulhe a lâmina no béquer de modo que metade da lâmina receba o tratamento e a outra metade permaneça sem tratamento e, em seguida, incube por 15 min à temperatura ambiente (Figura 1C).
- Anote de que lado da lâmina está recebendo o tratamento com amilase. Desenhe uma linha na parte de trás da lâmina indicando a fronteira entre o tratamento e o controle.
- Lave as lâminas com ddH2O para remover a solução de amilase e deixe a lâmina secar ao ar.
5. Realize coloração e imagem de Schiff com ácido periódico (PAS)
NOTA: Os reagentes PAS são tóxicos por inalação e corrosivos, portanto, as etapas precisam ser executadas em uma capela de exaustão química e os resíduos devem ser descartados adequadamente de acordo com as diretrizes institucionais.
- Coloque a lâmina em uma superfície plana e despeje 1,50-2,00 ml de solução de ácido periódico na amostra. Incube por 5 min em temperatura ambiente.
- Enxágue as lâminas em várias cargas de água destilada.
- Despeje 1,50-2,00 ml de reagente de Schiff na lâmina e incube-o em temperatura ambiente por 15 min.
- Lave a lâmina com água destilada por 5 min e deixe secar ao ar.
- Aplique 10 μl de mídia de montagem na lâmina e cubra com duas lamínulas pequenas ou aplique 50 μl e use uma lamínula grande.
- Aplique esmalte transparente nas bordas da lamínula, deixe secar durante a noite.
6. Obtenha imagens com o microscópio de luz binocular usando a objetiva 100X
