Coloração Cresyl Violet de Seções de Tecido: Um Procedimento de Coloração para Visualizar Cartilagem e Ossos em Seções de Embriões de Camundongos Congelados

Resumo

Fonte: Wu, Meng, et al., Microdissecção por captura a laser de cartilagem e osso embrionário de camundongo para análise de expressão gênica. J. Vis.(2019)

Este vídeo descreve o procedimento de coloração com violeta de cresil para visualizar ossos e cartilagens em cortes coronais de embriões de camundongos congelados. Essa técnica de coloração ajuda a diferenciar ossos e cartilagens com cores distintas dos tecidos circundantes.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de amostras para microdissecção por captura a laser

1. Prepare soluções para coloração e desidratação.
   1. Coloque 45 mL de etanol a 80% em cada um dos três tubos de centrífuga de 50 mL no gelo. Rotule-os como # 1, # 2 e # 3. Diluir o etanol com água isenta de RNase/DNase.
   2. Coloque 45 mL de etanol a 95% em um tubo de centrífuga de 50 mL no gelo.
   3. Coloque 45 mL de etanol 100% em um tubo de centrífuga de 50 mL no gelo.
   4. Colocar 45 mL de xileno em um tubo de centrifugação de 50 mL em temperatura ambiente.
      CUIDADO: O xileno deve ser usado em uma capela de exaustão.
2. Descongele brevemente uma lâmina de membrana PEN colocando-a contra uma mão enluvada e, em seguida, lave duas vezes por 30 s cada em 45 mL de etanol a 80% (# 1 e # 2) com agitação em tubos de centrífuga de 50 mL para remover o OCT.
   NOTA: É importante remover a OCT antes da coloração, para evitar que a OCT solta durante a coloração obscureça as seções. O fórceps pode ser usado para facilitar a remoção da OCT que não é lavada por agitação.
3. Coloque o slide em uma folha de papel alumínio. Pipete 0,8 mL de violeta de cresil a 0,1% em etanol a 50% na lâmina e core por 30 s. Lave a lâmina em 45 mL de etanol a 80% (# 3) por 30 s e, em seguida, desidrate por passagem por 30 s cada através de 45 mL de etanol a 95%, etanol a 100% e xileno em tubos de centrífuga de 50 mL.
4. Fique em pé em um limpador de tarefas delicadas por 5 min para drenar o xileno e as seções secas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de centrífuga	ThermoFisher Scientific	339653	Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno, 50 mL
Acetato de violeta cresil	Sigma-Aldrich	C5042
Limpador de tarefas delicadas	ThermoFisher Scientific	Telefone: 06-666
água destilada	Invitrogen	Rolamento 10977-015	Livre de DNase/RNase
Etanol absoluto (200 provas)	ThermoFisher Scientific	BP2818	Grau de biologia molecular
Lâmina de membrana PEN de vidro	Leica Microsystems	11505158
Composto de OCT	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 102094-106
Agente de descontaminação RNase	Sigma-Aldrich	R2020	Agente descontaminante RNase para limpeza de superfícies
xileno	Sigma-Aldrich	214736