Coloração de cristal violeta: uma técnica para visualizar células cancerígenas resistentes a medicamentos usando ensaios de formação de colônias

Neste artigo

Resumo

Fonte: Mohr, L. et al., Geração de Modelos de Células de Câncer de Próstata de Resistência ao Agente Antimitótico Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de viabilidade celular usando um procedimento de coloração violeta de cristal para células cancerígenas resistentes a medicamentos quimioterápicos.

Protocolo

1. Caracterização funcional da resistência adquirida ao docetaxel por ensaio de formação de colônias

NOTA: Neste protocolo, a quimiorresistência foi avaliada usando ensaios de formação de colônias. Métodos alternativos usados para avaliar a viabilidade celular (ou seja, ensaios MTS) podem ser usados com base nas preferências dos investigadores.

Placa de 2.000 células (DU145 ou 22Rv1, tanto parental quanto resistente ao docetaxel) por poço em placas de 6 poços, usando 2 mL de meio por poço.
Após 24 h, adicione concentrações crescentes de Docetaxel (células parentais: 0,25, 0,5, 1, 2,5 e 5 nM; Células DR: 50, 125, 250, 500 e 1.000 nM) para as linhagens celulares DU145 e 22Rv1. Adicione DMSO apenas a um poço como controle no mesmo volume usado para a dose mais alta de Docetaxel.
Após 72 h, aspire o meio contendo o medicamento e adicione um meio fresco sem docetaxel.
Incube as placas por 1-2 semanas até que as colônias sejam visíveis ao microscópio.
Para corar as colônias, lave-as suavemente com 2-3 mL de PBS e incube-as com 2-3 mL de solução de cristal violeta (0,1% p / v em formalina a 10%) por 20 min dentro da capela de cultura de tecidos ou capela de exaustão.
Remova a solução de coloração e lave as placas com 2-3 mL de H₂O, remova H₂O e seque as placas ao ar.
Analise o resultado visualizando os poços e contando manualmente as colônias com a ajuda de uma caneta marcadora (para evitar contar as mesmas colônias duas vezes) e represente a porcentagem de viabilidade celular em um gráfico. Tire imagens digitais das placas para representação da figura (Figura 1).

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Resultados

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Figura 1: Caracterização funcional e fenotípica dos modelos celulares resistentes ao docetaxel. Ensaios representativos de formação de colônias de células parentais e resistentes ao docetaxel tratadas com as concentrações indicadas de docetaxel por 72 h. A porcentagem de colônias para cada concentração de tratamento está representada no gráfico incluído. Os experimentos são triplicados e os dados representam a média ± DP. Barras de ...