Coloração fluorescente de prata: uma técnica para visualizar a proteína total em géis de poliacrilamida

1. Preparação do Gel

1. Execute SDS-PAGE com géis de proteína Bis-Tris a 4% - 12% (1 mm, 15 poços) usando um mini tanque de gel cheio de tampão de ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES).
2. Dilua as amostras com uma mistura de água destilada, tampão de dodecil sulfato de lítio (LDS) e um agente redutor de amostra.
3. Carregue a primeira pista com o dobro da quantidade de material (10 μL), seguida pela quantidade normal de material (5 μL) e uma série de diluições duplas do estoque depois disso (13 diluições, de 2x a 8192x).
4. Execute o gel a uma tensão constante de 200 V por 30 min.

2. Fixação do Gel

1. Após a eletroforese, mergulhe os géis em uma solução de 100 mL de etanol a 40% / ácido acético a 10% em um agitador orbital a 50 rpm à temperatura ambiente 2x (cada um por 30 min) ou durante a noite a 4 ° C.
2. Lave os géis 3 x 10 min cada em água ultrapura em um recipiente limpo. A etapa de lavagem é crítica. Se o ácido da solução de fixação não for removido adequadamente na etapa de desenvolvimento fluorogênico, o TPE-4TA excessivo será ativado pelo ácido e levará a uma forte fluorescência de fundo no gel.

3. Preparação da Solução de AgNO₃ e Impregnação de Prata do Gel

1. Para fazer a solução de AgNO₃ (0,0001%) para a impregnação, primeiro dissolva 0,01 g de AgNO₃ em 10 mL de água ultrapura para preparar uma solução estoque de AgNO₃ a 0,1%. Em seguida, adicione 100 μL da solução estoque de AgNO₃ a 0,1% em 100 mL de água ultrapura para fazer a solução de trabalho.
   nota: A solução de AgNO₃ deve ser armazenada no escuro antes do uso.
2. Impregnar o gel com 100 ml de solução de trabalho de prata durante 1 h num agitador orbital a 50 rpm num recipiente de vidro selado. É fundamental realizar a impregnação de prata sob uma hotte, protegida da luz com folha de alumínio.
3. Lave o gel com água ultrapura (cerca de 100 mL) em um recipiente limpo por 2 x 60 s.

4. Desenvolvimento fluorogênico do gel

1. Para preparar a solução estoque de corante (0,1 mM), adicione 3,0 mg do corante TPE-4TA em 50 mL de água ultrapura. Sonicar a solução por alguns minutos e adicionar um pouco de solução de NaOH (por exemplo, 1 M) para ajudar a dissolver o corante.
2. Verificar a fluorescência da solução sob uma lâmpada UV de 365 nm para garantir que a molécula de corante está totalmente dissolvida. Apenas soluções fracas ou não emissivas indicam dissolução total.
   nota: O corante TPE-4TA foi sintetizado seguindo o protocolo recentemente relatado por Xie et al.A solução TPE-4TA é muito estável e pode ser mantida no escuro por meses.
3. Para preparar 100 mL da solução de revelação fluorogênica (10 μM), adicione 10 mL da solução-mãe TPE-4TA em 90 mL de água ultrapura. Verificar o pH da solução com um medidor de pH e sintonizá-lo para 7 - 9 com uma solução de hidróxido de sódio (1 μM).
4. Transfira o gel para um recipiente limpo e lacrado com 100 mL da solução de revelação fluorogênica. Certifique-se de que o gel esteja totalmente imerso na solução. Feche o recipiente. Cubra-o da luz e agite-o durante a noite em um agitador orbital a 50 rpm à temperatura ambiente. Alternativamente, a etapa de incubação também pode ser encurtada para cerca de ~ 2 h pré-aquecendo a solução de revelação AIE a 80 ° C para coloração e deixando-a em temperatura ambiente.

5. Descoloração e imagem

1. Transfira o gel para um recipiente limpo e mergulhe-o em 100 mL de etanol a 10% por 30 min.
   nota: Só água pode ser usada para lavar o gel. No entanto, é mais eficiente em termos de tempo usar uma solução de etanol a 10% para a descoloração. Isso ajudará a reduzir o processo de descoloração de horas para 30 min.
2. Enxágue o gel em água ultrapura por 5 min.
3. Faça a imagem do gel no canal de 365 nm ou no canal de 302 nm por uma máquina de documentação de gel.